1.研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率占女性全身各种恶性肿瘤的7%-10%。全世界每年约有136万女性被诊断为乳腺癌,约有34万女性死于乳腺癌。手术清扫腋窝淋巴结导致淋巴结清扫遗漏,传统的化疗方法又致淋巴系统的药物含量低,导致癌细胞杀伤不彻底,造成复发转移,这些都是影响乳腺癌预后的重要因素。近几年针对淋巴结的化疗逐渐受到重视,淋巴结已经成为肿瘤化疗中一个非常有潜力的靶器官。淋巴系统可以吞噬大分子物质和微粒,故将化疗药与载体结合同时利用淋巴回流慢的特点,维持局部药物浓度平衡并缓慢释放化疗药。使淋巴结在较长时间内维持药物浓度较高,从而有效地杀伤淋巴系统内的肿瘤细胞,恢复淋巴细胞的功能,协助消灭残存的肿瘤细胞,减少肿瘤经淋巴途径转移；同时也控制药物进入血液循环的量,降低化疗的副反应¨。用作淋巴靶向治疗的载体有很多种,目前比较常用的有活性炭、脂质体、纳米微粒和脂质体等。对于这些载体的研究目前已经取得很大的进步,这些载体可使药物的更准确的到达靶淋巴系统,缓慢释放药物,降低不良反应等。但这些药物也有缺点,如携带药物的量比较少、粒径大小不稳定、靶向性不强等。所以选择与人体相容性好、粒径大小恒定并且能够稳定结合并缓慢释放药物,同时载体对机体无害,这种载体的发现对淋巴靶向化疗具有重大的意义。2.研究目的1.制备具有强吸附性和良好淋巴靶向性的载体—磁性多壁碳纳米管(O-mMWNT-PEG),了解其基本物理特性及其淋巴示踪性。2.探讨磁性多壁碳纳米管载负阿霉素后在体外对乳腺癌细胞的杀伤效应和在体内治疗乳腺癌淋巴结转移的疗效研究。3.研究设计建立BALB/c乳腺癌淋巴结转移小鼠模型,制备具有强吸附性和良好淋巴靶向性的载体—磁性多壁碳纳米管(O-mMWNT-PEG),并吸附阿霉素(Doxorubicin, DOX)制成DOX-O-mMWNT-PEG混悬液。将含相同阿霉素浓度的阿霉素、磁性多壁碳纳米管-阿霉素、磁性多壁碳纳米管分散液等体积注入乳腺癌淋巴结转移小鼠体内,观察DOX-O-mMWNT-PEG对肿瘤细胞的抑制作用。MTT法检测这3组分散液在体外对小鼠乳腺癌EMT-6细胞的抑制作用。3.1载负阿霉素的磁性多壁碳纳米管的制备和检测为了增加多壁碳纳米管的水溶性,首先利用H2SO4和HN03氧化多壁碳纳米管(MWNT)得到氧化多壁碳纳米管(Oxidized-MWNT, O-MWNT),再通过π-π吸附将DSPE-PEG2000和O-MWNT连接,得到O-MWNT-PEG。通过化学方法将纳米Fe304与O-MWNT-PEG结合得到磁性氧化多壁碳纳米管(O-mMWNT-PEG),制备用于载药的磁性微粒。用透射电镜对O-mMWNT-PEG进行形态观察,在常温下对O-mMWNT-PEG混悬液的稳定性和磁响应性进行观察。最后将这种磁性微粒吸附阿霉素(Doxorubicin, Dox)制成DOX-O-mMWNT-PEG。采用Zetasizer Nano ZS分别测定O-mMWNT-PEG和DOX-O-mMWNT-PEG的水化粒径和Zeta电位。采用紫外分光光度法测定DOX-O-mMWNT-PEG中的DOX的溶度,DOX的吸收波长为480nm。按照公式计算载药量(DL)。将O-mMWNT-PEG混悬液皮下注射于小鼠的足背用于研究O-mMWNT-PEG对小鼠淋巴结的示踪性。3.2体外对EMT-6细胞的抑制作用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定药物对细胞的杀伤力,MTT法被广泛地应用于测定细胞毒性和细胞增殖的实验方法。它的原理是MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)可以与线粒体内的脱氢酶发生还原反应生成紫色晶体状的产物,在溶解剂下,这种紫色产物可以被溶解。通过酶标仪测定其在570nm波长的吸光度,吸光度越高,细胞增殖越多,药物对细胞毒性越低；反之亦然。本实验通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测其对小鼠乳腺癌EMT-6细胞的体外杀伤效应。3.3BALB/c乳腺癌淋巴结转移小鼠模型的构建和体内药物疗效观察3.3.1动物模型的构建取对数生长期的小鼠乳腺癌EMT-6细胞,活细胞数>95%,用1×PBS液清洗3次,再用1×PBS液重悬细胞,调整细胞浓度为1×108·mL-,制备成细胞悬液放在4℃冰上。于BALB/c小鼠的左侧足背接种细胞悬液0.2mL/只。观察成瘤及胭窝淋巴结转移情况,5周后凡左侧胭窝有黄豆大小淋巴结者为合格动物模型。取其中3只处死,取左侧胭窝淋巴结和肿瘤组织,常规的石蜡包埋切片,行HE染色,光镜下检查。3.3.2动物分组和药物疗效观察选取接种瘤细胞5周后合格的小鼠模型42只,随机分成6组,每组7只。分别为：A组为生理盐水组：生理盐水皮下注射在小鼠左后肢；B组为O-mMWNT-PEG空白载体组：O-mMWNT-PEG混悬液皮下注射在小鼠左后肢,C组为DOX单药组：DOX溶液皮下注射于小鼠左后肢；D组为低浓度DOX-O-mMWNT-PEG不加磁场组,低浓度DOX-O-mMWNT-PEG混悬液皮下注射于小鼠的左后肢,并且不在淋巴结的部位固定永磁铁；E组为低浓度DOX-O-mMWNT-PEG加磁场组,低浓度DOX-O-mMWNT-PEG混悬液皮下注射于小鼠的左后肢,并且在淋巴结的部位固定永磁铁；F组为高浓度DOX-O-mMWNT-PEG加磁场组,高浓度DOX-O-mMWNT-PEG混悬液皮下注射在小鼠的左后肢,并且在淋巴结的部位固定永磁铁。观察不同处理的效果和小鼠全身毒副作用。淋巴结和肿瘤组织进行病理学检查,并用TUNEL法检测淋巴结内肿瘤细胞凋亡指数。4.结果4.1O-mMWNT-PEG的鉴定O-mMWNT-PEG混悬液呈黑色,分散均匀,略显粘稠。室温下稳定性良好,具有明显的磁响应性。O-mMWNT-PEG混悬液具有良好的淋巴示踪性,随淋巴液移行,经过淋巴结。碳纳米管注射部位的皮肤无明显过敏和毒性反应。组织学检查未发现小鼠重要脏器有碳纳米管的聚集。4.2载药量的测定采用紫外分光光度法测定DOX-O-mMWNT-PEG中DOX的浓度,按照计算公式得出载药率为83%。DOX最初母液浓度为1g/ml,载药率为83%,则制备成的DOX-O-mMWNT-PEG的DOX浓度为0.83mg/ml。4.3体外对EMT-6细胞的毒性抑制实验以PBS作为阴性对照,一系列不同浓度的DOX组、O-mMWNT-PEG组和DOX-O-mMWNT-PEG组作为实验组。MTT比色法结果表明,O-mMWNT-PEG组在浓度较大时,对乳腺癌细胞EMT-6的毒性仍小。DOX对乳腺癌细胞的抑制率具有量效依赖关系。含相同DOX剂量的DOX组和DOX-O-mMWNT-PEG组对EMT-6细胞的抑制作用差异无明显差异。所有这些表明在DOX-O-mMWNT-PEG药物配制过程中,DOX的药物活性未受到影响,在体外对EMT-6细胞起抑制作用的主要成分为DOX。4.4动物模型的鉴定处死3只荷瘤鼠,对肿瘤组织和转移的淋巴组织行病理检查,HE染色。在光镜下,肿瘤组织内可见细胞大小形态不一,核大深染,异形性明显,呈巢状、腺管状杂乱排列,并伴有坏死。转移淋巴结的病理检查结果显示癌细胞首先进入边缘窦,形成散在转移灶,之后肿瘤细胞堆积成明显的转移灶。4.5药物疗效观察O-mMWNT-PEG携载DOX后,在磁场作用下抗淋巴转移和抗肿瘤生长的效果较无磁场作用要好,高剂量DOX组的疗效优于低剂量组。与DOX单药组相比,在O-mMWNT-PEG的作用下,对小鼠淋巴转移和肿瘤生长的抑制作用明显增强,而O-mMWNT-PEG组与对照组比较,未发现明显的抗淋巴转移的效果。O-mMWNT-PEG携载或不携载DOX,在给药后,注射部位皮肤都有黑染,但是无红肿、过敏或溃疡,小鼠的健康状况也无影响,各项血常规和生化指标位于正常范围,而单用DOX组产生了白细胞下降,其余指标与其他组无明显差异。5.结论本实验通过化学方法将纳米Fe304与Oxidized-MWNT-PEG结合形成磁性氧化多壁碳纳米管(O-mMWNT-PEG),制备用于载药的磁性微粒。再将这种磁性微粒吸附阿霉素(Doxorubicin, Dox)制成DOX-O-mMWNT-PEG复合物。磁靶向给药系统(Magnetic targeted drug delivery system, MTDS)是将药物与适当的磁活性成分结合,在足够强的外磁场作用下,将载体定位于靶区,将其所含的药物定位在病变部位集中发挥作用。目前国内外大力研究MTDS作为一种新型药物的靶向系统来治疗恶性肿瘤。和常规化疗相比,磁性药物结合外磁场对肿瘤的选择性加强,全身不良反应小,疗效佳。近年研究证实,体外磁场对肿瘤本身就具有抑制作用。O-mMWNT-PEG是磁靶向给药系统中的有力武器,同时它具有淋巴示踪性,可用于指导手术中操作。本实验的体外实验能清楚显示磁性碳纳米管载药体系能够有效地抑制乳腺癌EMT6细胞的增殖,其起主要抑制肿瘤细胞增殖的成分是DOX；体内实验则表明磁性多壁碳纳米管能有效聚集在淋巴结内,长时间地释放药物,从而抑制乳腺癌细胞的生长和通过淋巴道的转移。O-mMWNT-PEG是一种新型的靶向药物载体,同时具有淋巴趋向和磁靶向给药的优点,是磁靶向给药系统中的有力武器。除了在手术中指导操作,此载体既能提高化疗药物抗肿瘤细胞的生长和增加抗淋巴转移的靶向治疗效果,又能降低药物的毒副反应。拥有诸如此上的优点,此种载体的应用前景非常广阔。