背景外周动脉闭塞或狭窄引起的肢体缺血性疾病(下肢动脉硬化闭塞症、糖尿病足、血栓性脉管炎等)是外科常见的致残性疾病，静息痛、皮肤溃疡或坏疽是下肢缺血性疾病典型的临床表现，以高发生率、高截肢率和高死亡率严重影响患者的生活质量。随着我国饮食结构的改变(摄入含脂食物增多)、人均寿命的延长以及检查诊断技术的改进，下肢缺血性疾病发病率逐年升高，已经成为危害人类健康的严重疾病。目前针对下肢缺血性疾病主要手段是药物、外科手术以及介入腔内治疗等。但是对于远端流出道严重狭窄尤其是合并糖尿病的患者往往没有手术机会，目前还缺乏令人满意的治疗方法。应用各种方法和平段促进新生血管生成，促进缺血肢体侧枝循环的建立，可能是有效可行的治疗方法之一。血管新生(angiogenesis)原指在已存在血管床的基础上血管内皮细胞增殖、迁移并重塑形成新的成熟血管，即从先前存在的血管上出芽生成新生毛细血管的过程。人体组织的正常生长均需要血管新生，成年女性子宫内膜的反复重建也是反复血管新生的过程；由于动脉狭窄或闭塞而引起组织、器官处于缺血状态，机体会形成代偿性的侧支血管，此均为生理性的血管新生。血管新生疗法，原是指通过应用外源血管生长因子(血管内皮生长因子VEGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF等)或其基因，以促进缺血组织内血管新生和侧支血管的形成，使缺血组织的缺血状态获得改善的治疗方法。血管发生(vasculogenesis)指发生在胚胎发育时期的血管内皮祖细胞(EPC)形成原始血管的过程。然而近年来发现在成年体内也存在EPC，主要分布于骨髓，循环外周血中也含有EPC，但含量极少。循环外周血中的EPC同样参与后天的血管新生。这就加深了对血管新生的认识，扩大了血管新生的概念。有学者认为在缺血、创伤等因素或某些因子动员下，骨髓EPC大量复制并释放至外周血液，定向迁移至缺血部位，定向增殖分化为血管内皮细胞，参与缺血组织的血管新生。并认为VEGF、bFGF、粒单-集落刺激因子(G-CSF)等促血管生成作用实质也是动员骨髓EPC的迁移、增殖、分化，而发挥血管新生效应。也有人认为血管新生和血管发生同时存在，共同改善局部缺血状态。各种血管生长因子控制着血管内皮细胞的增殖、分化和迁移，调节着血管新生整个过程的各个阶段。在组织缺血缺氧的情况下，组织产生各种促血管新生的因子的能力增强，并且可以动员循环中的细胞共同参与新血管的形成。bFGF被认为是体内最为有效的促血管生长因子之一。多个研究还发现bFGF有促进动脉生成的作用。不少学者应用bFGF基因研究血管新生，但随着蛋白备制、分离、提纯技术的发展，逐渐多的学者开始应用蛋白进行研究。研究表明，心肌梗死后内源性bFGF和VEGF增加。但bFGF和VEGF增加的量不足且时间短暂，在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量是近年来研究的热点。骨髓干细胞CD34~+细胞可分化为血管内皮细胞，而且干细胞能分泌如bFGF和促使血管管腔内皮化的细胞因子。bFGF等血管生长因子又可以促进干细胞增殖并向血管内皮细胞分化，诱导内皮细胞产生纤维酶原激活物和基质金属蛋白酶，从而降解基质，加速新生血管的管腔结构的形成和三维立体构像形成。很多学者已经开始了应用干细胞(骨髓干细胞、间充质细胞或单个核细胞)自体移植促进血管新生治疗缺血性疾病(下肢缺血、心肌缺血等)的动物实验研究和临床研究，并取得了一定效果。干细胞自我移植是应用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血，增加外周血中干细胞的数量，促使定向“归巢”到缺血组织的干细胞数量相应增加，同样可达到自体干细胞移植治疗缺血性疾病的效果。目的本实验通过皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)促使兔骨髓干细胞动员；在兔骨髓干细胞动员促使“干细胞自我移植”的基础上，兔缺血后肢肌内注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，观察其对缺血组织血管新生情况的影响及兔缺血肢体的改善情况。材料与方法选用成年健康日本大耳白兔40只，各实验兔均切断左侧股动脉及其分支，制作兔后肢缺血模型；随机分4组；bFGF组各兔在缺血后肢肌肉内多次注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)(n=10)，G-CSF组兔皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员兔自体干细胞释放和迁移至缺血组织(n=10)，bFGF+G-CSF组按bFGF组和G-CSF组的方法给予bFGF蛋白和G-CSF(n=10)，对照组给予等剂量生理盐水(n=10)。术后4周，各实验兔行腹主动脉造影观察缺血后肢侧支循环血管形成情况并拍摄X线片；取内收肌和腓肠肌肌肉行病理切片HE染色计数管腔由单个血管内皮细胞组成的毛细血管数目；并用免疫组织化学方法检测内收肌和腓肠肌中VEGF阳性表达的血管数。实验结果应用统计软件SPSS11.5处理。结果1大体观察麻醉意外死亡1只实验兔(bFGF+G-CSF组)，术后2d内因肠梗阻死亡1只实验兔(bFGF组)，术后4d因腹泻死亡1只实验兔(对照组)，术后5d和6d实验兔(G-CSF组)分别突然死亡1只，余均存活(生命体征平稳，饮食正常，精神状态良好等)。在观察时间内，各实验兔均未见到左后肢缺血性坏死；术后4d手术切口均愈合良好，无切口红肿、渗液等；对照组3只实验兔术后出现跛行，术后4天均能正常行走；对照组1只实验兔术后第2天左后肢出现足背部溃疡，约1cm×1cm大小，术后第5天溃疡愈合；其余3组各兔未出现跛行或溃疡；各实验兔均有不同程度的左后肢毛发脱落现象。2血常规情况G-CSF组和bFGF+G-CSF组各兔术后给予皮下注射G-CSF 10μg/kg，外周血中白细胞数量明显上升，第6天白细胞数最高达26.2×10~9/L～43.6×10~9/L，平均达35.3×10~9/L，且在第4天高倍镜下就可检测到幼稚细胞。停止皮下注射G-CSF后，外周血白细胞迅速下降，第9天基本恢复正常。其余2组各兔外周血中白细胞数量未有明显变化5.4×10~9/L～10.2×10~9/L，平均8.6×10~9/L。皮下注射G-CSF的G-CSF组和bFGF+G-CSF组与未进行皮下注射G-CSF的对照组和bFGF组之间第6天的白细胞数量有显著性差异(P＜0.05)；而G-CSF组与bFGF+G-CSF组、对照组与bFGF组之间均无统计学意义(P＞0.05)。3侧支血管数腹主动脉造影拍摄的各X线片均显示左侧股动脉连续性中断，远端股动脉均显影良好，并出现不同数量的侧支循环血管。bFGF+G-CSF组各X线片上均显示出现密集的侧支血管，呈网状分布，分别连接在中断的股动脉之间；bFGF组显示较密集的紊乱的侧支血管；G-CSF组显示出一定数量的侧支血管形成；对照组也显示出少量的侧支血管。在腹主动脉造影X线片上经股骨中点画一条垂直于股骨纵轴的直线，记录通过该直线显示的血管数，定义为该实验兔左后肢侧支血管数。bFGF+G-CSF组侧支血管数多于bFGF组(P=0.034)，也多于G-CSF组(P=0.001)；bFGF组侧支血管数多于G-CSF组(P=0.036)；3个实验组侧支血管数均多于(P＜0.05)。4毛细血管计数HE染色的兔左后肢内收肌和腓肠肌组织切片，每一标本随机选取5个视野，在400倍显微镜下观察计数管腔由单个血管内皮细胞组成的毛细血管数目，由两人独立分别计数毛细血管数目，其平均值即为毛细血管数。bFGF+G-CSF组均可见满视野由单个血管内皮细胞组成的毛细血管分布于肌束间；bFGF组可见较多的毛细血管；G-CSF组也可见不少的毛细血管；对照组可见稀疏的毛细血管。bFGF+G-CSF组血管密度多于bFGF组(P=0.000)，也多于G-CSF组(P=0.000)；bFGF组侧支血管数多于G-CSF组(P=0.002)；3个实验组侧支血管数均多于对照组(P＜0.05)。5 VEGF阳性表达的血管数VEGF抗体S-P二步法免疫组化法染色的切片，在光学显微镜下观察，血管内皮细胞胞浆染色呈棕黄色者为阳性细胞，该毛细血管即为VEGF阳性表达的血管。每一标本随机选取5个视野，在400倍显微镜下观察计数VEGF阳性表达的血管数，由两人独立分别计数染色之微血管数目，其平均值即为VEGF阳性表达的血管数。bFGF+G-CSF组均可见肌束间大量胞浆黄染的毛细血管；bFGF组可见较多胞浆黄染的毛细血管；G-CSF组也可见不少胞浆黄染的毛细血管；对照组可见稀疏胞浆黄染的毛细血管。VEGF阳性表达的血管数依次为：bFGF+G-CSF组＞bFGF组＞G-CSF组＞对照组(均为P＜0.05)。结论1．在兔缺血后肢肌肉内多次注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，方法简单易行，安全可靠，可促进血管新生，增加缺血后肢血液灌注，改善肢体缺血状态；2．单纯皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)可促使兔骨髓干细胞动员，可促进兔缺血后肢的血管新生，增加侧支循环，改善肢体缺血状态；3．通过皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)促使兔骨髓干细胞动员；在兔骨髓干细胞动员促使“干细胞自我移植”的基础上，兔缺血后肢肌内多次注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，可共同促进缺血组织内血管新生，建立更丰富的侧支循环，使组织缺血得到更充分的改善，效果优于单独应用bFGF蛋白或骨髓干细胞动员。