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目的在前期研究工作中,根据中药复方益智健脑颗粒的组方,从其主要组成药物中筛选出治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的有效成分组合—淫羊藿苷(Icariin, ICA)与三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins, PNS),本次研究以ICA联用PNS对AD模型小鼠—P8系快速老化小鼠(senescence-accelerated prone mice8, SAMP8)进行干预,检测干预后SAMP8的行为学改变,并应用从蛋白质组学技术分析ICA联用PNS治疗AD的潜在作用靶点,探讨其防治AD的作用机制。方法将50只6月龄雄性SAMP8随机分为低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组、模型组和西药对照组,每组10只;另设10只R1系抗快速老化小鼠(senescence accelerated resistant mouse1, SAMR1)为正常对照组。低、中、高剂量治疗组均以ICA+PNS灌胃(剂量依次为2.5+20mg/kg,5+40mg/kg,10+80mg/kg),西药对照组以多奈哌齐灌胃(剂量为1mg/kg),模型组和正常对照组以等剂量双蒸水灌胃。8周后,以Morris水迷宫对各组小鼠进行行为学测试,分析其学习记忆能力的变化;同时,从低、中、高剂量治疗组之中筛选出最佳剂量组,作为后续实验中的治疗组;行为学测试结束后,应用双向凝胶电泳技术分别分离治疗组和模型组SAMP8海马组织总蛋白,以胶体考马斯亮蓝染色,Image Scanner图像扫描仪及Image Master双向凝胶电泳软件对图像进行扫描分析,以模型组图像为参照对象,选取治疗组中部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析,得到肽质量指纹图谱,经MSDB和NCBInr数据库查询,鉴定差异表达蛋白质;采用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction, RT-PCR)技术对部分差异表达蛋白质进行验证,同时检测这些差异表达蛋白在正常对照组SAMR1海马组织中的表达水平。结果1.行为学测试结果显示,模型组小鼠的逃避潜伏期较正常对照组明显延长(P<0.05),且停留在原平台象限的时间和跨平台象限次数较正常对照组明显减少(P<0.05);与模型组小鼠相比,中剂量治疗组、高剂量治疗组及西药对照组小鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),而停留在原平台象限的时间和跨平台象限次数明显增加(P<0.05);中剂量治疗组、高剂量治疗组与西药对照组小鼠之间的逃避潜伏期及停留在原平台象限的时间和跨平台象限次数均无明显差异(P>0.05),据此认为中剂量组为最佳剂量组。2.以模型组的双向凝胶电泳图谱为参照,发现治疗组与模型组存在23个差异点,其中12个在治疗组表达上调,11个表达下调。选取变化较为明显、边界较为清晰、无明显拖尾现象的差异蛋白质点进行鉴定:最终得到鉴定的有12个点,其中有7个在治疗组表达上调,5个表达下调。根据蛋白质数据库中提供的信息,发现这些差异表达蛋白治疗的AD作用机制涉及调节Ap代谢、抑制tau蛋白异常磷酸化、抗氧化应激、减轻脑内炎症反应、改善线粒体能量代谢障碍、抑制神经细胞凋亡等方面。3.差异蛋白验证结果:(1) Western blot验证结果:本次实验采用western blot技术检测flotillin-1和HMGB1在治疗组、模型组、西药对照组SAMP8及正常对照组SAMR1海马组织中的表达水平。结果显示:与模型组相比,flotillin-1和HMGB1在治疗组、西药对照组、正常对照组的表达明显下降(P<0.05),而二者在治疗组与西药对照组之间的表达水平无明显差异(P>0.05)。上述结果与蛋白质组学实验结果相符。(2)RT-PCR验证结果:本次实验同时采用RT-PCR技术检钡HMGB1和Ngb在治疗组、模型组、西药对照组SAMP8及正常对照组SAMR1海马组织中的表达水平。结果显示:HMGB1在治疗组、西药对照组及正常对照组的表达较模型组明显下降(P<0.05);Ngb在治疗组、西药对照组及正常对照组的表达较模型组明显增高(P<0.05);而二者在治疗组与西药对照组之间的表达水平均无明显差异(P>0.05)。上述结果与western blot的结果一致,亦与蛋白质组学实验的结果相符。结论1.ICA联用PNS能显著改善AD模型小鼠SAMP8的学习能力及记忆巩固、再现能力。2.ICA联用PNS可调节AD模型小鼠SAMP8海马组织的多种蛋白质表达,对AD的治疗是多靶点、多途径的。3.ICA联用PNS可能通过调节flotillin-1、HMGB1、Ngb等蛋白质的表达水平来发挥其治疗作用,而这些蛋白质可能是防治AD的潜在靶点蛋白。