研究背景免疫系统是恶性肿瘤发生发展的天然屏障,其中适应性T细胞免疫发挥最主要的抗肿瘤效应。然而,肿瘤微环境中浸润T细胞的丰度极低,同时肿瘤细胞能利用多种机制诱导浸润性T细胞的无功能,是肿瘤免疫逃逸的主要因素之一。因此,提高肿瘤特异性T细胞的浸润数量及免疫杀伤功能是抗肿瘤免疫治疗最重要的策略。目前的肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点阻滞(ICB)治疗及过继性T细胞转移(ACT)两类。ICB治疗采用特异性中和抗体阻断T细胞表而的负调控信号及通路,可以增强肿瘤微环境中已浸润T细胞的活性;而ACT通过外源性输注肿瘤特异性的杀伤性T细胞,增强患者的抗肿瘤免疫应答。虽然上述治疗策略在临床实践中取得了一定的成功,但仍面临较大的挑战:1.大部分实体肿瘤患者对ICB治疗存在原发性或获得性耐药,提示单独ICB治疗不足以逆转肿瘤中复杂的免疫抑制性微环境。2.以抗原嵌合受体T细胞(CAR-T)治疗为代表的ACT在实体肿瘤中的临床获益并不显著。究其原因,除了肿瘤细胞自身的异质性外,复杂的免疫抑制性微环境如免疫检查点分子、炎性细胞因了及抑制性代谢产物等抑制了过继性T细胞的移行浸润及免疫应答。因此,开发新的免疫治疗靶点及不同作用机制的免疫治疗策略的联合应用是目前临床及临床前研究的热点问题。免疫球蛋白样转录子4(ILT4)是免疫球蛋白超家族的膜型抑制性受体,主要表达于髓系抗原提呈细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DCs)及粒细胞表面。ILT4胞内段具有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIMs),可以抑制免疫细胞的激活、抗原提呈及免疫应答。在小鼠中ILT4的同源分子为配对的免疫球蛋白样受体B(PIR-B)。近年研究表明,ILT4与PIR-B也表达于肿瘤微环境中,包括肿瘤细胞及肿瘤间质细胞如造血干细胞(HSCs)、髓源性抑制细胞(MDSCs)及肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)等,调控肿瘤细胞的恶性生物学行为、HSC再生及巨噬细胞M2样极化,进而诱导效应T细胞的失功能及抑制性T细胞分化,扩大了免疫抑制性微环境。基于此本人首次提出“ILT4可作为新型免疫检查点分子参与恶性肿瘤免疫治疗”的新概念。但是肿瘤源性ILT4对肿瘤浸润性T细胞命运及功能的调控尚不清楚。T细胞老化是肿瘤微环境中T细胞失功能的新机制,其核心特征为T细胞的周期阻滞,表型特征为共刺激分子CD27/CD28表达下调、抗增殖分子p16/p53/p21等表达上调、促炎/抑制性细胞因子如IL-6、IL-8、IFN-y、TNF-α分泌增加,且具有直接的免疫抑制效应。研究表明,肿瘤细胞及间质细胞组分如调节性T细胞(Tregs)及骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以诱导肿瘤特异性T细胞的老化,促进肿瘤免疫逃逸。机制研究显示,乏氧诱导的肿瘤源性代谢产物cAMP可通过通道连接直接传递到T细胞中,活化T细胞LCK/cAMP/PKA/CREB信号通路,进而介导其免疫老化。但是肿瘤源性ILT4在肿瘤细胞诱导的T细胞老化中的地位及作用不详。研究目的本研究将首先明确ILT4在非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌等多种肿瘤中的高表达及其临床意义,扩展ILT4作为肿瘤治疗靶点的普适性;其次构建体外肿瘤-T细胞共培养体系及小鼠移植瘤模型,研究ILT4对T细胞的老化诱导及功能调控,明确肿瘤源性ILT4在恶性肿瘤发生发展及免疫逃逸中的地位;再次通过检测ILT4调控的肿瘤细胞脂代谢酶及代谢产物变化、信号通路蛋白的变化及相应脂代谢/信号通路抑制剂明确ILT4调控T细胞老化的代谢机制及分子信号通路;最后,利用小鼠恶性黑色素瘤的过继性T细胞治疗模型,探讨肿瘤细胞ILT4阻滞对过继转移的肿瘤特异性CD8+T细胞免疫老化及杀伤能力的逆转效应,提出ILT4阻滞联合ACT作为抗肿瘤免疫治疗策略的可行性。研究方法1.第一部分:肿瘤源性ILT4通过诱导T细胞老化介导肿瘤免疫逃逸。1)采用real-time PCR及流式细胞术检测人肿瘤细胞株及上皮细胞株中ILT4的表达,采用免疫组化检测NSCLC及乳腺癌患者组织中ILT4的表达,并统计分析其与患者临床病理特征和总生存(OS)的相关性;通过GEO数据库分析人NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤肿瘤组织中ILT4的表达与患者预后的相关性;综合论证ILT4高表达是恶性肿瘤的普遍特征,预示患者的不良预后。2)real-time PCR及流式细胞术检测小鼠肿瘤细胞株及上皮细胞株中PIR-B(小鼠中1LT4同源分子)的表达;并采用细胞生长、粘附及划痕实验研究小鼠肿瘤细胞中PIR-B过表达/敲除对肿瘤增殖、粘附及侵袭转移能力等恶性生物学行为的影响;3)利用基因转染及敲除技术,分别上/下调ILT4低/高表达肿瘤细胞中的ILT4,通过肿瘤细胞与T细胞的共培养体系明确ILT4对T细胞老化的诱导作用;4)在C57BL/6J小鼠中皮下注射PIR-B过表达/敲除的乳腺癌细胞株E0771构建肿瘤生长模型,研究PIR-B表达状态对肿瘤的成瘤率及生长进展的影响;取上述模型中肿瘤组织、脾脏、淋巴结及外周血,利用SA-β-Gal染色及流式细胞术检测不同组织中T细胞亚群分化及老化T细胞的数量、功能;明确PIR-B对肿瘤生长及T细胞老化的双重影响;5)在NSG小鼠中皮下注射PIR-B过表达/敲除的乳腺癌细胞株E0771构建肿瘤生长模型,观察免疫缺陷小鼠中PIR-B对肿瘤生长的影响;2.第二部分:肿瘤源性ILT4诱导T细胞老化的机制研究。1)通过real-time PCR及油红染色检测ILT4过表达/敲除的肿瘤细胞中脂代谢相关酶的基因表达水平及脂滴生成变化,明确ILT4是否调控肿瘤细胞脂代谢;2)利用相应脂代谢酶抑制剂预处理ILT4过表达的肿瘤细胞后再与T细胞共培养,从功能水平验证脂代谢参与ILT4诱导的T细胞老化;3)筛选过表达/敲除ILT4的肿瘤细胞中信弓·通路蛋白的变化,并通过相应信号通路抑制剂探讨ILT4诱导肿瘤细胞脂代谢及T细胞老化的特异性分子信号通路;3.第三部分:阻断肿瘤细胞ILT4增强了过继性T细胞治疗疗效。利用Pmel TCR转基因小鼠获得gp100抗原特异性CD8+T(gp100-CD8+T)细胞,建立小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型,并利用基因敲除技术阻断肿瘤细胞PIR-B表达,采用SA-β-Gal染色及流式细胞术检测肿瘤特异性T细胞的老化状态及杀伤能力,研究PIR-B阻滞对过继性T细胞治疗疗效与肿瘤特异性CD8+T细胞老化和功能的影响。研究结果1.第一部分:肿瘤源性ILT4通过诱导T细胞老化介导肿瘤免疫逃逸。1)ILT4在多种肿瘤细胞中高表达,且与患者不良预后相关。人NSCLC、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌细胞株中ILT4在基因及蛋白水平的表达均显著高于正常上皮细胞株;NSCLC及乳腺癌患者肿瘤组织中肿瘤细胞ILT4的表达较周围正常上皮细胞显著升高,且与患者淋巴结转移、TNM分期及较差的OS正相关。GEO数据库分析显示NSCLC、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中ILT4的高表达预示患者较短的无进展生存(PFS)及OS。2)PIR-B(小鼠中ILT4同源分子)在小鼠肿瘤细胞中高表达,调控其增殖、粘附、侵袭迁移等生物学行为。小鼠肺癌、乳腺癌及恶性黑色素瘤细胞中PIR-B在基因及蛋白水平的表达均显著高于正常上皮细胞;肿瘤生长、粘附及划痕实验证实PIR-B过表达/敲除分别促进/抑制了肿瘤细胞的增殖、粘附及迁移能力。3)肿瘤源性ILT4体外诱导了 T细胞的老化。与正常上皮细胞相比,NSCLC、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌细胞显著诱导了共培养的CD4+及CD8+T细胞的老化,降低了 T细胞表面共刺激分子CD27、CD28的表达,同时上调了 T细胞中细胞周期阻滞蛋白p53与p21的表达。共培养体系中加入ILT4中和抗体(anti-ILT4)显著逆转了肿瘤细胞诱导的CD4+及CD8+T细胞的老化;分别用anti-ILT4预处理肿瘤细胞或T细胞后再进行肿瘤-T细胞共培养实验,证实肿瘤来源而非T细胞来源ILT4诱导了T细胞的老化;分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后再进行肿瘤-T细胞共培养实验,验证了肿瘤源性ILT4诱导了 T细胞的老化。4)PIR-B体内诱导效应T细胞的老化及免疫抑制,促进肿瘤发生发展。全基因C57BL/6J小鼠乳腺癌移植瘤模型中肿瘤细胞E0771过表达/敲除PIR-B后分别促进/抑制了小鼠体内肿瘤的生长及外周血与肿瘤组织中浸润性T细胞的老化,同时分别抑制/促进了外周血及肿瘤组织中浸润性CD4+/CD8+T细胞的免疫功能(表现为CD4+T细胞中IFN-y减少/增加,CD8+T细胞中IFN-y、GranzymeB与Perforin的减少/增加)。NSG小鼠肿瘤生长模型中PIR-B的过表达/敲除同样促进/抑制了小鼠体内乳腺癌的生长,但变化趋势明显小于全基因的C57BL/6J小鼠,提示免疫系统参与了 PIR-B诱导的肿瘤发生发展。2.第二部分:肿瘤源性ILT4诱导T细胞老化的机制研究。1)ILT4通过调控肿瘤细胞脂肪酸合成诱导了 T细胞的老化。Anti-ILT4抑制了肿瘤细胞中脂肪酸合成关键酶ACCl及FASN的基因表达,且显著降低了肿瘤细胞中脂滴形成;分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后显著下/上调了脂代谢基因ACCl、FASN的表达与脂滴形成。用脂肪酸合成酶抑制剂C75预处理ILT4过表达的肿瘤细胞,然后进行肿瘤-T细胞共培养,结果显示C75预处理逆转了 ILT4诱导的CD4+及CD8+T细胞的老化。2)ILT4通过激活MAPK ERK1/2信号通路介导了肿瘤细胞脂肪酸合成及T细胞老化。分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后显著下/上调了ERK1/2的磷酸化水平:MEK抑制剂U0126预处理ILT4过表达的肿瘤细胞逆转了 ILT4上调的ACCl与FASN表达及细胞内脂滴形成;U0126预处理ILT4过表达的肿瘤细胞后再进行肿瘤细胞-T细胞共培养实验,证实ERK1/2阻滞逆转了 ILT4诱导的CD4+/CD8+T细胞的老化。3.第三部分:阻断肿瘤细胞ILT4增强了过继性T细胞治疗疗效。小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型中,gp100-CD8+T细胞显著抑制了恶性黑色素瘤细胞B16F0的体内生长,而B16F0中PIR-B基因敲除进一步抑制了肿瘤的生长。B16F0中PIR-B基因敲除逆转了外周血及肿瘤组织中浸润的gp-100-CD8+T细胞的老化,增强了其IFN-γ的释放与免疫杀伤效应。结论1.ILT4/PIR-B在多种肿瘤细胞中高表达,与患者不良预后相关;体内外研究证实肿瘤源性ILT4/PIR-B不仅促进肿瘤恶性生物学行为,而且诱导了 CD4+及CD8+T细胞的老化,抑制了其杀伤活性,进而促进肿瘤进展。2.肿瘤源性ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸的合成及脂质堆积,进而诱导T细胞的老化。3.小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型中PIR-B阻滞逆转了过继转移的肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫老化,增强了其杀伤活性及抗肿瘤疗效;提示ILT4阻滞可以逆转实体肿瘤中ACT耐药,二者联合是有效的抗肿瘤免疫治疗策略。