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癌症是威胁人类生命最严重的疾病之一,据美国癌症协会2015年最新的年度统计数据报告显示肺癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌仍然是癌症死亡的最常见原因。世界癌症报告估计2012年我国癌症发病人数约360万,癌症死亡人数约为220万,约占全球癌症死亡人数的四分之一,而90%的肿瘤病人死于癌症的转移。转移是肿瘤恶性行为的特征性表现,也是临床治疗失败的主要原因,控制转移成功与否是决定癌症患者生存与否的关键。但肿瘤是多基因控制的复杂疾病,深入研究癌症发生与转移的分子机制,对未来的靶向治疗癌症具有非常重要的作用。Notch信号通路高度保守,最先发现是在胚胎发育和细胞分化方面起作用,随后的大量研究发现异常活化的Notch信号通路与肿瘤的发生和发展有关。Notch-1及其配体的过表达与乳腺癌的预后率密切相关。然而,Notch-1信号通路在乳腺癌中的作用机制并不清楚。本研究以高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231为研究对象,首先分析Notch家族受体Notch-1对乳腺癌细胞恶性行为的作用,证实了Notch-1活化促进乳腺癌细胞的生长、黏附、迁移和侵袭等恶性行为。然后阐明了Notch-1促进细胞迁移的机制。研究内容如下:1.细胞模型的构建:通过反转录PCR从人脑胶质瘤细胞系U251细胞中获取人Notch-1胞内段(NICD)的序列全长cDNA,并克隆到载体pcDNA3.1(+)中。通过瞬时转染进MDA-MB-231细胞中,经Real-time PCR和Western blot鉴定转染后细胞中NICD成功过表达。Notch-1 shRNA经瞬时转染后也有效降低Notch-1的表达。2.Notch-1对乳腺癌细胞恶性行为的作用:(1)通过CCK-8、平板克隆以及软琼脂糖克隆形成实验分析细胞增殖能力证明过表达NICD能够促进细胞增殖,而沉默Notch-1则会抑制细胞增殖。(2)通过流式细胞术和Calcein AM/PI双染发现NICD过表达促进细胞周期大量进入S期并抑制细胞凋亡,沉默Notch-1则将细胞周期阻滞才G0/G1期且促进细胞凋亡。(3)通过细胞黏附分析实验、划痕实验以及Transwell小室实验证实NICD过表达促进细胞的黏附、迁移和侵袭。相反,沉默Notch-1则抑制细胞的黏附、迁移和侵袭能力。以上实验表明Notch-1活化对细胞的恶性行为有促进作用。3.Notch-1促进MMP-2、MMP-9、VEGF的表达:Real-time PCR和明胶酶谱实验证实Notch-1活化促进MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,并增强MMP-9的活性。沉默Notch-1则抑制MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,且MMP-9的活性也随之降低。4.Notch-1活化NF-κB信号通路:(1)通过免疫荧光、western blot、EMSA、双荧光素酶报告基因检测证明Notch-1活化导致IκBα降解,促进NF-κB的p65亚基入核转移,并增强NF-κB与DNA的结合活性和转录活性。沉默Notch-1抑制IκBα降解,导致p65入核转移减少,NF-κB的DNA结合活性和转录活性都降低。(2)Western blot分析证明Notch-1活化促进NF-κB下游靶基因Cyclin D1、Bcl-xL、Survivin的表达。说明Notch-1活化能够激活NF-κB信号通路。5.Notch-1促进细胞侵袭依赖于NF-κB的活性:(1)LPS刺激促进细胞侵袭,并拮抗Notch-1沉默导致的细胞侵袭能力降低。NF-κB抑制剂处理抑制细胞的侵袭能力,并阻断NICD过表达引起的细胞侵袭能力增强。(2)抑制Notch-1活性,LPS处理仍能够增加MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。而抑制NF-κB,活化的Notch-1不能促进MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。以上结果说明Notch-1促进细胞侵袭必须依赖于NF-κB活性。6.Notch-1活化NF-κB的机制:(1)Western blot分析证明Notch-1活化激活PI3K/AKT信号通路,而抑制PI3K磷酸化则Notch-1活化不能增强AKT的磷酸化水平。(2)Western blot和免疫荧光技术证明抑制AKT磷酸化,Notch-1活化不能诱导p65入核转移。说明Notch-1通过PI3K/AKT途径活化NF-κB。(3)活化Notch-1增强PP2A的磷酸化水平,抑制其活性。PP2A抑制剂OA(冈田酸)抑制PP2A活性后Notch-1沉默不能降低PI3K、AKT的磷酸化水平。免疫荧光染色和western blot分析证实OA抑制PP2A活性后沉默Notch-1不能减少p65入核转移。双荧光素酶报告基因检测也证实了OA抑制PP2A活性增强NF-κB的转录活性,且逆转Notch-1沉默引起的NF-κB转录活性降低。说明Notch-1通过PP2A调控了NF-κB的活性。综上所述,本论文通过分析Notch-1在乳腺癌生长和转移方面的作用,明确了Notch-1活化会促进细胞的生长、黏附、迁移和侵袭。阐明了Notch-1促进细胞恶性行为的机制是调控PP2A活性而调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路的活性,进而调节下游与细胞周期、细胞凋亡和运动相关靶基因的表达。该研究阐明了Notch-1调控乳腺癌细胞迁移的机制,并为相关临床研究提供了相应和理论依据和实验基础。