论文部分内容阅读
[目 的]明确lncRNA CCT5P2在肺癌中的表达情况;探讨lncRNA C CT5P2促进肺癌生长、增殖和天然免疫逃逸的作用;验证lncRNA CCT5P2/miR-129-5p/CD155通路参与肺癌恶性表型维持的真实性,为肺癌免疫治疗增敏提供潜在的分子靶标,并为克服肺癌天然免疫逃逸提供理论基础。[方法]（一）采用原位杂交方法检测180例肺癌组织和配对的癌旁组织中lncRNA CCT5P2的表达情况;采用qPCR方法检测7株肺癌细胞株中lncRNA CCT5P2的表达情况;采用荧光原位杂交实验定位lncRNA CCT5P2在肺癌细胞中的表达。（二）利用shRNA技术干扰A549和SPC-A-1肺癌细胞中lncRNA CCT5P 2表达,建立稳转细胞株,为了防止脱靶效应,设两个干扰组,分别命名为shR NA#1和shRNA#2,对照组为ctrl shRNA;通过qPCR验证shRNA稳转细胞株中lncRNA CCT5P2的表达情况;通过细胞增长实验观察干扰lncRNA CCT5P2对肺癌细胞A549和SPC-A-1生长的影响;通过细胞克隆形成实验观察干扰lnc RNA CCT5P2对肺癌细胞A549和SPC-A-1增殖的影响;为进一步明确干扰lnc RNA CCT5P2对NK细胞抗肿瘤免疫功能的影响,我们从健康成人外周血中分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,再利用磁珠分选技术募集CD3-CD56+的细胞亚群,行体外扩增、培养及细胞纯度鉴定后,分别与CCT5P2干扰的SPC-A-1肺癌细胞株共培养,检测NK细胞分泌效应细胞因子INF-γ和TNF-α的含量。（三）分别筛选shRNA和过表达质粒稳转细胞株,干扰和上调lncRNA CC T5P2表达,通过qPCR检测A549和SPC-A-1细胞miR-129-5p的表达情况,验证lncRNA CCT5P2与miR-129-5p的相互作用;分别在肺癌细胞A549和SPC-A-1中转染miR-129-5p mimic,应用qPCR技术检测CD155 mRNA的表达情况,应用双荧光素酶基因报告系统验证miR-129-5p与CD155的直接相互作用;采用WB检测干扰lncRNA CCT5P2表达后,CD155蛋白的表达情况,明确lncRNA CCT5P2与CD155的相互作用;分别在肺癌细胞A549和SPC-A-1中转染miR-129-5p mimic,通过细胞增长、克隆形成实验检测miR-129-5p对细胞生长和增殖能力的影响;在lncRNA CCT5P2稳转的干扰细胞株中,通过过表达质粒上调CD155表达行挽救实验,检测细胞生长和增殖能力的变化。[结 果]（一）肺癌组织中lncRNA CCT5P2表达上调,较癌旁组织显著增高;肺癌细胞株中lncRNA CCT5P2表达较正常肺上皮明显增高;A549细胞中lncRNA CCT5P2表达主要定位于细胞质。（二）利用shRNA技术成功构建shRNA-CCT5P2肺癌A549和SPC-A-1稳转细胞株;下调lncRNA CCT5P2表达后,A549和SPC-A-1细胞生长、增殖受到抑制;流式细胞术检测磁珠分选培养后的CD3-CD56+NK细胞占比为86.7%;下调lncRNA CCT5P2表达后,促进NK细胞分泌效应因子IFN-γ和TNF-α。（三）下调 lncRNA CCT5P2 表达后,A549 和 SPC-A-1 细胞中 miR-129-5p表达显著上调,上调lncRNA CCT5P2表达后,A549和SPC-A-1细胞中miR-129-5p表达显著下调;上调miR-129-5p表达后,A549和SPC-A-1细胞中CD155 mRNA表达下调;双荧光素酶基因报告系统结果显示A549与SPC-A-1细胞中m iR-129-5p与CD155直接相互作用;下调lncRNA CCT5P2表达后,A549和SP C-A-1细胞中CD155蛋白表达下调;上调miR-129-5p表达,A549和SPC-A-1细胞生长、增殖受到抑制;上调A549和SPC-A-1细胞shRNA#2组中CD155表达后,挽救下调lncRNA CCT5P2介导的细胞生长、增殖抑制现象。[结论]1.肺癌中lncRNA CCT5P2高表达。2.肺癌中高表达的lncRNA CCT5P2具有促进肺癌细胞生长、增殖及天然免疫逃逸的作用。3.肺癌中高表达的lncRNA CCT5P2可以竞争性结合miR-129-5p,发挥miR-129-5p的海绵作用,下调miR-129-5p表达,进而正向调控CD155表达,lncRNACCT5P2/miR-129-5p/CD155通路在肺癌中真实存在。4.肺癌中高表达的 lncRNA CCT5P2 通过 lncRNA CCT5P2/miR-129-5p/CD155通路发挥促进肺癌生长、增殖及天然免疫逃逸的作用。