卡那霉素是一种含有2-脱氧链霉胺(DOS)的氨基糖苷类(AmAc)抗生素,已经保持了几十年的广谱抗菌活性。近年来,由于致病菌耐药性的出现使得卡那霉素的临床应用受到了限制,卡那霉素半合成衍生物,如阿米卡星、地贝卡星和阿贝卡星等已被广泛用于解决抗药性的问题。目前,我们实验室已经成功设计和优化了从卡那霉素B到地贝卡星和阿贝卡星的化学合成路线,并且达到了较高的收率。然而,卡那霉素B的供应不足严重限制了其产量,导致这类抗生素的价格昂贵。在未经改造的卡那霉素链霉菌的代谢产物中,卡那霉素A是主要产物,卡那霉素B作为副产物,其产量仅为卡那霉素A的1/9。为解决卡那霉素B供不应求的问题,构建富产卡那霉素B的工程菌株具有迫切性和重要意义。首先针对kanJ基因设计了 2条不同的sgRNA,通过酶切酶连的方式分别连接在pCRISPR-Cas9原始质粒上,再通过Gibson组装在StuI位点插入kanJ的左右同源臂,为其进行同源修复提供模板。成功构建kanJ敲除质粒后,通过接合转移的方式使其进入卡那霉素链霉菌中,在硫链丝菌素的作用下激活Cas9蛋白,成功敲除kanJ基因。△kanJ菌株发酵产物中卡那霉素B的平均产量可达到537.20 mg/L,相较于野生型菌株,卡那霉素B的产量提高了将近10.7倍。△ kanJ菌株的发酵产物中仅含有卡那霉素B,实现了单产卡那霉素B。其次探讨了卡那霉素代谢途径中调控基因kanG、kanL的功能。分别构建kanG、kanL多表达质粒,通过接合转移的方法,将kanG、kanL多表达质粒分别整合在卡那霉素链霉菌的基因组上,最终通过抗性筛选得到了kan 多表达菌株和kanL多表达菌株。kanG多表达菌株的发酵产物中卡那霉素A的产量为387.00 mg/L,卡那霉素B的产量为46.66 mg/L。kanL多表达菌株的发酵产物中卡那霉素A的产量为408.07 mg/L,卡那霉素B的产量为51.62 mg/L。