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目的： 乳腺癌是全世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。线粒体DNA的突变已经在很多人类肿瘤中被观察到。线粒体DNA调控区D-loop区相较于线粒体DNA的其它区域累积突变的频率更加迅速。本文首先通过对两个乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的研究建立线粒体DNA的D-loop区基因突变和线粒体DNA拷贝数改变的检测方法；其次通过测定乳腺癌患者组织和外周血以及家族性乳腺癌家系成员外周血线粒体基因组D-loop区突变的频率和分布研究这些突变产生的机制及在肿瘤发生中的作用；此外，进一步对这些标本线粒体DNA拷贝数改变进行了分析，探讨了线粒体DNA的D-loop区的突变和拷贝数改变与乳腺癌发生及与遗传性乳腺癌易感性的关系。 方法： 第一部分：体外培养乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，从对数生长期细胞中提取线粒体DNA，PCR扩增线粒体DNA的D-loop区，与T载体连接后在大肠杆菌DH5 α中克隆，测序分析突变；以含有D-loop区的T载体为标准，用real-time实时定量PCR扩增两个细胞系线粒体DNA的D-loop区以检测线粒体DNA的绝对拷贝数。 第二部分：取30例乳腺癌组织标本、30例乳腺癌患者的外周全血标本、42例遗传性乳腺癌家系成员的外周全血标本和30例健康献血员的外周全血标本，采用E.N.Z.A Tissue和Blood DNA试剂盒分别提取总DNA。利用Oligo6.2软件设计三对引物把线粒体DNA的D-loop区分成三段分别进行PCR扩增，利用单链核苷酸多态性(SSCP)电泳筛选可疑突变区域。在发生突变的包含线粒体DNA复制和转录起始区和微卫星不稳定热点区D310区的128-599片段的PCR产物直接送交测序。测序结果用软件DNASTAR与已公布的剑桥序列比较以分析突变的频率和分布，序列 天津医科大学硕士学位论文 变化根据Mitomap database判断为多态性或新发现的多态性和突变位 点。第三部分:以第一部分所得的连接有线粒体DNAD一1。叩区片段的克隆载体质 粒为标准，用real一time实时定量PCR对与第二部分相同的四组标本进 行IntDNA拷贝数的绝对定量测定，并分析各组的差异。结果:第一部分:在我们测序的两个细胞系的线粒体DNA的D一looP区中，各自发现 了9个突变，它们包括点突变、插入/删除突变，突变率占D一10op区全 长的0.8%，其中MCF一7的四个突变和MDA一MB一231的两个突变发生在H 链的复制起始区。两个细胞系在D一310的C一Stretch区均存在突变。此 外，我们在MDA一MB一231细胞中还发现了复杂的基因重排。用real一t ilne 实时定量PCR我们测定两个细胞系线粒体DNA的拷贝数分别是4.84x 10’5 and 5.63xlo’5 eopy/ugnNA。第二部分:用PCR一 SSCP我们在30例乳腺癌组织中筛选出巧例(50%)存在 突变，30例乳腺癌外周血中13例(43.3%)存在突变，与正常外周血(6%) 相比其差别有统计学意义(P<0.05)。在12例128一599片段存在突变的 组织中我们共发现了66个突变:51个为点突变，其中23个为 举C，巧个为A卜G;5个为插入突变;10个为删除突变;21个突变分 别发生在所有12例标本中的D31O区，且每个组织中的D310区突变各 不相同，可见此区确是突变高发区域;52个突变为已报导过的多态性， 其余14个为新发现的多态性和突变。在所有突变中263位点的A，以 489位点的T，C是12例组织共有的突变位点。在新发现的D一1。。p区 的多态性和突变位点中，12例组织中有6例(50%)在D3 10区311一313 位点出现了CC或CCC deletion。 用PCR一SSCP我们还在42例乳腺癌家系成员的外周血中筛选出30例 天津医科大学硕士学位论文 (71.4%)存在突变，与散发的乳腺癌患者外周血(43.3%)相比，差 别没有统计学意义(P>0.05);与正常对照相比(6%)差别有统计学意 义(P<0 .05)。在23例128一599片段存在突变的家系成员外周血中我们 共发现了126个突变:92个为点突变，其中41个为T，C，32个为 A卜G;20个突变为插入突变;14个突变为删除突变;37个分别突变发 生在所有23例标本中的D3lO区;122个突变为已发现的多态性，其它 的4个为新的多态性和突变位点。23例家系外周血在263和489存在相 同与组织的263和489位点的突变。而310位点的年C，311一312位点 的Te insert，522一523位点的CA deletion和527位点的C，G则是 这些成员中的高发突变位点。与散发的乳腺癌组织的测序结果相比， D31O区311一313位点仍发现有CC或CCC删除。在研究的三个典型家系 中，同一家族中的乳腺癌家系成员的突变除D310区外基本相同。第三部分:用real一time实时定量PCR，我们检测出乳腺癌组织的线粒体DNA 的拷贝数的平均值是7.75 xlo’:，C叩y/ugDNA，它高于乳腺癌病人外周血 的平均值3.22 X 10”eopy/ugDNA(P<0.05)和正常对照的平均值6.55火 10‘。copy/u gDNA(P<0 .05)。我们也检测出乳腺癌家系成员的平均值为 1.64xl0，Zeopy/ugDNA，它高于乳腺癌病人外周血的平均值(P(0.05) 和正常对照的平均值(P<0 .05)。结论: 我们的研究发现