支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早产儿常见的呼吸系统疾病,其典型的病理改变为气道结构异常和肺泡发育不良,具体表现为气道上皮细胞分化异常,肺泡数量减少,肺泡结构破坏,肺泡问质增生等结构功能的改变。BPD的发病机制仍不十分清楚,目前发现的可能的致病因素包括：早产、子宫内环境、氧气治疗和机械通气,感染与炎症等因素。除了以上外在因素外,遗传因素异常在BPD的发生过程也有重要意义,但是目前对BPD模型的表观遗传学的研究较少,本研究将从发育生物学的角度来探究表观遗传学因素在BPD发生过程中的的作用机制。表观遗传学是研究没有DNA序列变化的,但可遗传的基因表达的改变。组蛋白修饰是表观遗传学研究的一个重要方向,包括乙酰化,甲基化,磷酸化以及核糖基化等。调控组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶,其中乙酰化由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acelyltransferase, HAT)催化完成,去乙酰化则由组蛋白去乙酰化酶(Histone deacelylase, HDAC)介导。目前的研究发现的哺乳动物的HDACs总计18种,按照其结构和功能分为4组,分别为Ⅰ型,Ⅱa型,Ⅱb型和Ⅳ型。Ⅰ型HDACs家族包含四个成员,分别是HDAC1,HDAC2, HDAC3和HDAC8。HDACs被证明在促进细胞的增殖和抑制凋亡过程中发挥重要作用。除此之外,随着近年来小鼠同源重组和基因敲除技术的进步,人们发现HDACs在多种器官的发育过程中也发挥不同的组织特异性功能。本实验室的前期研究发现Ⅰ型HDACs(HDAC1、HDAC 2和HDAC 3)在整个小鼠胚胎发育过程中在肺内广泛、持续表达,提示其在肺器官发育过程中中可能发挥重要作用。在肺上皮细胞内组织特异性敲除HDAC1和HDAC2基因,会导致肺的近端气道(proximal airway)发育不良。同样,在肺上皮细胞中敲除HDAC3基因,会抑制在肺泡Ⅰ型上皮细胞(AT1)在肺发育晚期肺泡形成阶段的重塑功能,导致AT1扩张障碍和肺泡塌陷。除了肺上皮细胞内,HDAC3在整个胚胎发育阶段同时也肺间质细胞内广泛表达,在本研究中,我们构建HDAC3组织特异性敲除小鼠模型来探明肺间质细胞中HDAC3缺失导致小鼠肺发育不全的作用机制。第一部分：HDAC3基因缺失导致小鼠肺发育不良为了研究为了研究HDAC3基因在小鼠胚胎肺发育中的重要作用,我们首先要明确在胚胎发育的不同时期HDAC3基因在小鼠肺内的表达模式。我们对胚胎发育各个时期的肺组织切片进行HDAC3免疫荧光染色,实验结果显在肺发育的整个过程中,HDAC3在肺上皮细胞和间质细胞中持续而广泛的表达,我们可以推测HDAC3在小鼠肺发育过程中可能发挥重要的作用。为了进一步研究肺间质细胞中HDAC3基因在肺发育过程中的作用机制,我们利用Cre-loxP系统组织特异性敲除目的基因。我们在HDAC3基因4-7号外显子两端分别插入一个LoxP位点,在Cre酶作用下将HDAC3基因的4-7号外显子将被切除。Dermo1-Cre转基因小鼠是间质细胞特异性转基因小鼠,该小鼠的Cre重组酶活性由间质细胞特异性蛋白Dermo1基因的启动子调控,可达到在间质细胞特异性表达Cre重组酶的目的。我们将HDAC3flox/flox转基因小鼠与Dermo1-Cre+/-转基因小鼠杂交,获得HDAC3flox/+;Dermo1Cre+/-基因型小鼠后代,后者再次与HDAC3flox/flox小鼠杂交后可获得敲除两个HDAC3基因的纯合体。(HDAC3flox/flox;Dermo1 Cre+/-基因型,又记作HDAC3Dermo1CreKO)分别于小鼠胚胎发育的不同时期解剖小鼠取胚胎肺,对其进行基因组鉴定,部分肺叶组织固定包埋切片,用于HE染色和免疫荧光染色。部分肺组织加入细胞裂解液提取总RNA,用于Q-PCR分析实验。我们通过免疫荧光染色来检测Dermo1-Cre重组酶的效率,发现在肺间质细胞中几未检测出HDAC3蛋白,提示杂交小鼠在Cre重组酶的作用下有效敲除了在肺间质细胞中的HDAC3基因。95%以上的HDAC3Dermo1CreKO基因型的新生小鼠在出生后几小时内因呼吸窘迫死亡。组织学分析实验发现,HDAC3Dermo1CreKO基因型的小鼠胚胎肺较野生型(WT)对照组略减小,但肺叶数量和位置未见异常,肺叶边缘不规整,提示存在肺间质发育不良。高倍镜视野下可见气道分枝化形态发生正常,提示HDAC3不是气道分枝化形态发生的必要因素。E18.5肺组织切片的HE染色显示实验组小鼠的肺泡数量减少,部分肺泡塌陷,肺间隔显著增厚,肺扩张存在明显障碍。肺泡发育畸形导致无法形成有效的气体交换平面以建立正常的呼吸功能,是新生小鼠致死的主要原因。。综上所述,肺间质细胞中HDAC3的重要作用可能贯穿整个小鼠胚胎肺发育过程,早期HDAC3基因缺失导致肺间质发育不良,但是不会影响肺上皮细胞的分枝化形态发生过程。在胚胎发育的晚期原始肺泡发育阶段,HDAC3基因缺失会导致远端气道的发育缺陷。HDAC3具体以何种机制参与到肺泡晚期远端气道的组织分化调控,是我们下一步的研究重点。第二部分：HDAC3在小鼠肺间质细胞增殖和分化过程中的作用第一部分的组织学分析结果显示,HDAC3DermolCreKO基因型小鼠胎肺较野生型(WT)明显减小,由此我们推测肺间质细胞HDAC3基因缺失导致的肺发育不良可能是由于肺上皮细胞或者肺间质细胞的增殖能力下降所引起的。为了评估HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺发育过程中肺内细胞增殖是否受到抑制,我们对胚胎发育不同时期的肺组织切片行PO4-H3免疫荧光染色和TTF-1、BrdU双重染色以检测细胞增殖率,统计分析发现PO4-H3和TTF-1-BrdU+细胞比例与对照组(WT)相比明显减少,TTF-1+BrdU+细胞占总细胞数百分比无明显变化,说明肿间质细胞内HDAC3缺失直接影响肺间质细胞的增殖能力,但是肺上皮细胞的增殖未受到影响。众所周知,HDACs会通过调节基因表达来参与细胞周期的调节,主要通过细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)、细胞周期蛋白(Cyclins)的正向调控和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CKIs)的负向调控来实现。我们对HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺组织内表达的细胞周期相关因子进行Q-PCR分析发现,在肺间质细胞HDAC3基因缺失的小鼠肺组织内,细胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1和CDK1的mRNA表达水平显著下降；P27的mRNA表达较对照组显著升高,其他相关细胞周期蛋白和激酶无明显变化。这个结果与早前研究报道相一致,提示HDAC3是通过细胞周期相关因子来参与调控细胞周期以达到控制细胞生长的目的,而其中的具体的分子生物学机制尚未完全清楚,可能是一个多因素参与的复杂过程。在肺发育的过程中,肺间质细胞会发育分化成多种细胞系,如平滑肌细胞(smooth muscle cells)、内皮细胞(endothelial cells)、周细胞(pericytes)和间质成纤维细胞(interstitial fibroblasts)。为了研究HDAC3对肺中胚层来源的细胞系分化的影响,我们对转基因小鼠肺组织切片行特异性细胞标志物免疫荧光染色。1.小鼠肺组织切片行Sox2和SM22双重免疫荧光染色,结果显示HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠气道平滑肌未见异常,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响间质细胞源性平滑肌细胞的分化。2.内皮细胞标志蛋白Pecam表达在HDAC3基因缺失的肺组织内未见异常,Q-PCR结果显示内皮细胞特异性标志物的mRNA表达与蛋白表达水平相-致,说明HDAC3未参与肺内皮细胞分化的调控。3. 间质成纤维细胞几个重要标志物Pdgfr-b和Vmentin的蛋白和mRNA表达在HDAC3基因缺失的小鼠肺组织中显著降低。HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠和野生型对照小鼠的肺组织中分离的肺间质细胞进行体外培养,免疫荧光染色结果显示Ki67+和Pdgfr-b+细胞占总细胞的百分比明显降低,提示肺间质细胞特异性敲除HDAC3影响肺间质来源的成纤维细胞的增殖和分化。第三部分HDAC3在小鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞分化过程中作用机制的研究小鼠胚胎发育至E17.5,肺的发育由气道分枝化形态发生阶段进入原始肺泡形成阶段。这个阶段包含远端气道末端扩张呈囊和肺泡上皮细胞分化两个主要的发育过程。为了研究肺间质细胞HDAC3基因缺失是否影响肺上皮细胞的分化,我们采用组织切片免疫荧光染色和Q-PCR分析来检测肺上皮细胞的细胞标志物的蛋白和mRNA表达：1.肺泡1型上皮细胞(AEC 1)的细胞标志物AQP-5和T1-alpha的蛋白和mRNA表达在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中明显减低,提示AEC 1细胞分化障碍。2.肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC 2)的细胞特异性标志物Sftpc、Sftpb和Abca在HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织的表达未见明显异常,说明肺间质细胞特异性敲除HDAC3未影响AEC 2细胞的分化和成熟。3.纤毛上皮细胞特异性细胞标志物Foxj1和beta-tublin Ⅳ,分泌细胞标志物Scbg1a1,HDAC3Dermo1CreKO转基因小鼠肺组织中这些近端气道的上皮细胞的标志物的表达与对照组相比(WT)无明显差异,提示HDAC3基因不参与肺近端气道上皮细胞的分化和发育的调控。为了研究肺间质细胞内HDAC3缺失导致肺泡扩张障碍和AEC 1细胞分化不全的的分子机制,我们采用磁珠分选的方法分离肺上皮细胞和间质细胞,并对其进行Q-PCR分析。实验结果显示HDAC3缺失的EpCAM-的肺间质细胞中配体Wnt2和Wnt5的表达明显下降；EpCAM+的肺上皮细胞中配体Wnt5a和Wnt7a表达同样受到抑制,经典Wnt信号通路中常见的目的基因Axin2、Lef-1和CyclinD1的表达明显减低。以上实验结果证实肺间质细胞特异性敲除HDAC3会抑制Wnt信号通路配体的表达,进一步导致经典Wnt/p-catenin信号通路的活性下降。HDAC3在胚胎肺发育晚期的肺泡扩张和AEC1分化成熟的过程发挥重要作用,体外肺组织培养实验验证了在胚胎肺发育晚期抑制Wnt/β-catenin信号通路活性可以造成肺发育晚期AEC1分化缺陷,同时挽救实验中在胚胎发育晚期给孕鼠腹腔注射Wnt信号通路激动剂LiCI可以缓解肺间质细胞HDAC3缺失导致的肺发育不良。由此我们可以得出结论,肺间质细胞内的HDAC3对肺发育晚期AEC1的分化成熟具有重要意义,HDAC3Dermo1CreKO转基因的小鼠的肺内AEC1的分化缺陷是由于肺上皮细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性减低所引起的,而HDAC3作为上游的调控因子对Wnt/β-catenin信号通路活性发挥调节作用。