目的:肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是全亚洲最常见的恶性肿瘤,病死率居所有恶性肿瘤之首。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占原发性肺癌的80%~85%。大多数非小细胞肺癌患者确诊时已处晚期,中位生存期仅有12.9个月。目前非小细胞肺癌的治疗模式是以手术、放化疗和分子靶向治疗为主的综合性治疗。但由于多数患者发现时已经丧失手术的机会,预后极差。因此,寻找肺癌治疗的新策略成为研究的焦点。近年来,肿瘤免疫治疗成为继分子靶向治疗之后的新热点,其中以抗PD-1(programmed cell death-1,程序性死亡受体1)及其配体PD-L1(programmed cell death-ligand 1,程序性死亡配体1)为代表的免疫检验点抗体在晚期肿瘤的治疗上取得重大突破,为肿瘤患者的治疗带来新的曙光。肿瘤免疫主要是T细胞免疫过程,通过T细胞的活化特异性杀伤肿瘤细胞。随着对抗原递呈过程研究的深入,发现T细胞的活化依赖两类信号:一是MHC(major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体)分子和T细胞受体结合的信号,另一类是抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)表达的协同共刺激分子与T细胞表面相应受体相互作用的信号。协同共刺激分子包括正向刺激因子和负向刺激因子,正向刺激因子包括CD28、CD137等,负向刺激因子主要包括CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,细胞毒T淋巴细胞相关抗原4)和PD-1。PD-1/PD-L1作为负向共刺激分子之一,在正常情况下,介导负性调控信号抑制T细胞增殖和功能,避免T细胞过度活化。肿瘤细胞也可以表达PD-L1,当这种抑制通路被肿瘤利用后,用来对抗免疫系统,减弱机体自身抗肿瘤的免疫应答,使肿瘤细胞免于机体免疫系统的监视和清除。正向刺激因子的激动剂或是负向共刺激因子的抑制剂都可以提高对肿瘤的免疫杀伤作用。在多项NSCLC的临床研究中,PD-1单抗一线及二线治疗晚期NSCLC,无论总生存还是客观缓解率均优于标准化疗组,并已获批NSCLC一线及二线治疗适应症。抗PD-1/PD-L1单抗虽然在疗效上取得了巨大成功,但目前根据PD-L1的表达并不能准确的预测疗效及评价预后,究其原因,从机制上讲主要与以下两点有关:肿瘤细胞上PD-L1的表达调控机制尚不完全清楚;其次,PD-1/PD-L1通路除了在T细胞活化过程介导负性调控信号,是否还有其他功能尚不清楚。因此,深入探讨肿瘤细胞上PD-L1的表达调控机制及发挥的功能,对于评估患者免疫状态、判断临床预后及预测治疗疗效具有重要的意义。在肺癌的驱动基因中,EGFR是截止至目前为止最重要也是研究最广泛的基因。虽然酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已经改变了EGFR激活突变患者的的治疗方案,但野生型EGFR患者的特异性治疗策略有限且发展缓慢。最近,几项III期临床试验表明,与携带EGFR突变的患者相比,抗PD-1/PD-L1抑制剂在野生型EGFR患者中更为有效。此外,研究表明,肿瘤的基因突变可能与PD-L1表达相关。一些研究提示EGFR突变通过NSCLC中的下游途径诱导高PD-L1表达。然而,目前有关EGFR野生型肺癌PD-L1的表达的调控机制尚不清楚,更无有效的疗效预测指标。因此,深入研究EGFR野生型肺癌PD-L1的调控机制将会为今后治疗提供新的思路及线索。既往研究证实,T细胞表面的Cbl-b蛋白发挥其E3泛素连接酶活性,通过与底物蛋白特异性结合,诱导其泛素化降解,抑制T细胞过度活化,是一种免疫抑制分子。c-Cbl是泛素连接酶Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)家族的另一个成员,其结构和功能与Cbl-b类似。近年来的研究发现,泛素连接酶Cbl家族除了在免疫激活过程中发挥重要的抑制性功能,也能够在肿瘤细胞中负性调控STAT3、AKT、ERK等酪氨酸激酶的活性,而这些酪氨酸激酶也是调节肺癌细胞PD-L1表达的关键因素。因此,我们推测,Cbl-b和c-Cbl可能参与了EGFR野生型肺癌细胞PD-L1表达调控,但目前尚无报道。材料与方法:本研究以人EGFR野生型肺癌细胞株A549和H460为模型,研究Cbl家族蛋白调控肺癌细胞PD-L1表达的机制,同时对PD-L1参与肿瘤细胞侵袭转移进行了初步探讨,并进一步在肺癌组织标本中分析PD-L1的表达及临床意义。1、采用Western blot方法检测STAT3,p-STAT3,AKT,p-AKT,ERK,p-ERK,Cbl-b,c-Cbl,PD-L1,E-cadherin,Vimentin和GAPDH蛋白的表达。2、采用Transwell法测定细胞迁移能力。3、采用Real-time PCR技术检测miRNA-181a和mi RNA-940的表达水平。4、采用GeneChip miRNA Array筛选差异表达的miRNA。5、免疫组化染色检测肺癌组织标本中PD-L1、PD-1与Cbl-b、c-Cbl的表达。6、流式细胞仪检测通过PE单染细胞表面PD-L1、PD-1的表达。7、统计学处理:使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。每次实验重复3次,数据以均值±标准差((?)±s)表示。组间差异采用t检验,临床病理参数相关性分析,不同组间比较采用卡方检验及Fisher确切概率法,利用Kaplan-Meier绘制生存曲线,并行log-rank检验计算P值。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、STAT3/AKT/ERK通路参与调控EGFR野生型肺癌细胞的PD-L1的表达。选择EGFR野生型的两种肺腺癌细胞系A549和H460,流式细胞仪及Western blot检测两种细胞天然状态下细胞表面及细胞内总PD-L1的表达。结果显示,A549细胞无论是细胞表面还是细胞内总PD-L1均为低表达,H460细胞为高表达。Western blot检测同时发现,H460细胞p-STAT3、p-AKT、p-ERK水平高于A549细胞。为了验证STAT3/AKT/ERK通路是否参与PD-L1表达调控,本研究在PD-L1高表达的H460细胞中分别加入STAT3抑制剂STATTIC(2μM)、PI3K/AKT抑制剂LY294002(25μM)、ERK抑制剂PD98059(20μM)观察24及48小时,与对照组相比,在处理组p-STAT3、p-AKT、p-ERK水平下调的同时,PD-L1的表达也下调。我们又在H460细胞中分别利用两种不同序列siRNA瞬时敲除STAT3/AKT/ERK基因后,H460细胞PD-L1的表达下调。上述结果提示,STAT3/AKT/ERK通路上调EGFR野生型肺癌细胞PD-L1的表达。2、Cbl-b和c-Cbl通过抑制STAT3/AKT/ERK通路,下调肺癌细胞PD-L1表达。Western blot检测发现,PD-L1低表达的A549细胞,Cbl-b和c-Cbl蛋白高表达,PD-L1高表达的H460细胞,Cbl-b和c-Cbl蛋白低表达。在Cbl-b和c-Cbl高表达的A549细胞中,利用siRNA瞬时敲减Cbl-b和c-Cbl后,发现下游p-STAT3、p-AKT、p-ERK蛋白表达上调,同时,细胞表面及细胞内总PD-L1表达上调,当联合敲减后,这种变化更加明显。为了进一步验证该结论,将Cbl-b和c-Cbl质粒转染至H460细胞,过表达Cbl-b和c-Cbl后,下游p-STAT3、p-AKT、p-ERK蛋白表达下调,PD-L1表达下调。这说明,Cbl-b和c-Cbl通过抑制STAT3/AKT/ERK通路,下调EGFR野生型肺癌细胞PD-L1的表达。3、miR-181a和miR-940分别通过靶向Cbl-b及c-Cbl,间接调控PD-L1表达。Western blot检测提示A549细胞的Cbl-b和c-Cbl蛋白水平高于H460细胞,而PCR结果却发现mRNA水平与蛋白水平不一致,这提示,可能存在转录后机制参与Cbl-b和c-Cbl的蛋白表达调控。为了明确microRNA是否参与Cbl-b和c-Cbl的转录后调控,我们利用Affymetrix HTA2.0芯片对比分析了A549和H460两种细胞的microRNA表达谱,将表达差异较为明显的miRNA制成热点图。利用生物信息学网站(http://www.mirdb.org/miRDB/)进行靶基因预测筛查,筛选靶向Cbl-b和c-Cbl的miRNA。用Real-Time PCR验证芯片结果显示,miR-181a与miR-940与芯片变化趋势一致且结果稳定。为了进一步验证Cbl-b和c-Cbl分别为miR-181a和miR-940的靶蛋白,利用miRNA mimics在A549细胞中过表达miR-181a与miR-940后,Cbl-b和c-Cbl表达下调,下游p-STAT3、p-AKT、p-ERK和PD-L1表达上调;利用miRNA inhibitor在H460细胞抑制miR-181a与miR-940的表达后,Cbl-b和c-Cbl表达上调,下游p-STAT3、p-AKT、p-ERK和PD-L1下调。从上述结果看出,miR-181a和miR-940分别通过靶向Cbl-b和c-Cbl间接调控PD-L1的表达。4、PD-L1诱导肺癌细胞上皮间质转化,促进细胞迁移。在PD-L1高表达的H460细胞中,利用siRNA瞬时敲减PD-L1,发现上皮标志物E-ca上调,间质标志物Vimentin下调。Transwell结果显示,敲减PD-L1组细胞迁移能力较对照组降低60%,这说明,抑制PD-L1后,可以逆转肺癌细胞上皮上皮间质转化(EMT)。同时,我们在transwell小室的下室中加入同样数目的活化Jurkat细胞或2.5%血清的空白对照,上室分别加入同样数目的A549和H460细胞,PD-L1低表达的A549细胞,下室加入Jurkat细胞组与对照组比较,穿过transwell小室的细胞数无明显变化,而PD-L1高表达的H460细胞,下室加入Jurkat细胞后,穿过transwell小室的细胞数明显增多。为了验证迁移能力的增强是否与PD-L1/PD-1反应有关,再次利用siRNA敲减技术,瞬时敲减H460细胞PD-L1基因,在下室加入同样数目Jurkat细胞的条件下,穿过transwell小室的细胞数减少,增强的迁移能力被抑制,但仍高于下室为2.5%血清的空白对照组。5、肺癌组织中PD-L1与临床病理学参数的关系及与Cbl-b、c-Cbl表达的相关性。我们选取了经手术切除的133名非小细胞肺癌患者,采用免疫组化方法检测组织中的PD-L1、PD-1、Cbl-b、c-Cbl的表达,同时收集患者的临床病理信息并定期对患者进行随访。结果显示,PD-L1在肿瘤细胞上的阳性表达率为36.8%(49/133),Cbl-b阳性表达率为53.4%(71/133),c-Cbl的阳性表达率为45.9%(61/133)。Spearman相关性分析表明Cbl-b的表达与PD-L1的表达呈显著负相关,r=-0.349,p<0.001,c-Cbl的表达与PD-L1的表达同样呈显著负相关,r=-0.234,p=0.007。PD-L1的表达与吸烟状态和病理类型显著相关(P<0.001),也与淋巴结转移情况(P=0.046)和组织学分化程度(P=0.040)相关。生存分析显示,PD-L1表达与患者总生存有统计学相关性(P=0.023),PD-L1表达越高,生存期越短。这种相关性在腺癌中更明显(P=0.019)而在鳞癌中不具有统计学意义(P=0.526)。PD-L1与PD-1双阳性患者差相对于双阴性患者或PD-L1/PD-1单一阳性患者,生存期明显缩短(P=0.001)。结论:1、STAT3/AKT/ERK通路上调EGFR野生型肺癌细胞PD-L1表达。2、Cbl-b和c-Cbl通过抑制STAT3/AKT/ERK通路,下调EGFR野生型肺癌细胞PD-L1的表达。3、miR-181a和miR-940分别通过靶向Cbl-b及c-Cbl,间接调控PD-L1表达。4、PD-L1诱导肺癌细胞上皮间质转化,促进细胞迁移。5、肺癌组织中PD-L1与Cbl-b、c-Cbl表达负相关,PD-L1高表达的患者更容易出现淋巴结转移,生存期更短。PD-L1与PD-1双阳性的患者预后最差。