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研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种典型的慢性自身免疫性疾病,在我国发病率高、预后差。SLE的发病机制十分复杂,其中凋亡细胞清除障碍是目前公认的重要发病机制之一。Tim (T cell immunoglobulin domain and mucin-domain-containing molecule)是2001年新发现的免疫调节分子家族,它们在调节过敏、哮喘、移植耐受、自身免疫以及介导凋亡细胞清除中起重要作用。Tim分子具有独特的结构,其胞外IgV区含有磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)结合位点,人类Tim家族的三个成员Tim-1、Tim-3和Tim-4都能够识别PS。文献报道,Tim-1仅表达于Th2细胞,不表达于吞噬细胞。Tim-3主要达在Thl细胞上,负性调节Thl细胞的免疫反应。近来发现Tim-3也表达在固有免疫细胞如巨噬细胞和树突状细胞,介导凋亡细胞的吞噬。Tim-4选择性表达于抗原提呈细胞,尤其高表达于巨噬细胞,能够介导对凋亡细胞的摄取、吞噬和免疫耐受。已有研究表明,Tim-3分子的单个核苷酸多态性(SNP)易感于特发性血小板减少性紫癜(ITP)和类风湿性关节炎(RA),SLE患者Tim-3mRNA表达水平高于正常人,但无显著性差异,而SLE病人中Tim-4的mRNA表达水平显著增高,提示Tim-3和Tim-4分子可能通过影响凋亡细胞吞噬参与SLE的发生。本课题首次从凋亡细胞清除障碍入手探讨Tim-3和Tim-4分子在SLE发生中的作用及Tim-4的单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与SLE发生的相关性。目的检测Tim-3和Tim-4在SLE单个核细胞中的表达水平；分析其表达水平与疾病活动度的相关性以及Tim-4分子启动子区域1419(rs6874202)、-1609(rs62382402)位点SNP与SLE发生的相关性。方法1.检测Tim-3和Tim-4分子在单个核细胞中的表达1.1流式细胞术检测外周血CD14+细胞上Tim-3的表达收集SLE患者和健康对照者的肝素抗凝血,破红细胞,以荧光标记的CD14、Tim-3抗体进行染色,流式细胞术检测Tim-3在外周血CD14+单核细胞上的表达。1.2实时定量PCR检测外周血单个核细胞上Tim-4mRNA的表达收集SLE患者的肝素抗凝血,分离患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。用Trizol法抽提总RNA,逆转录成为cDNA后,用subgreen荧光探针法以实时定量PCR检测Tim-4mRNA表达水平。2. Annexin-V/PI双染流式细胞术检测外周血细胞凋亡收集SLE患者和健康对照者的肝素抗凝血,破红细胞后,加入2ml冰预冷的PBS,1000rpm离心5min,弃去上清,加入PBS进行细胞计数,取2×105个细胞,离心后弃掉PBS,加入500μl凋亡检测用缓冲液,混匀后,避光加入FITC标记的Annexin-V2μl及PI2μl混匀,室温避光孵育10min,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。3.流式细胞术检测Tim-3和Tim-4基因转染的HEK293T细胞对凋亡细胞的吞噬作用构建人Tim-4真核表达载体pcDNA3.0-hTim-4。小鼠胸腺细胞以10μ mol/L地塞米松于无血清培养基孵育4h诱导胞凋亡,并用PHrodo-SE进行标记。利用脂质体将pcDNA3.0-hTim-3和pcDNA3.0-hTim-4转染HEK293T细胞,转染24h后,与凋亡的胸腺细胞以1：10比例混合于37℃孵育90min,流式细胞术检测胸腺细胞的凋亡率及HEK293T细胞转染前后对凋亡细胞的吞噬情况。4.PCR和测序分析Tim-4基因启动子区域-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)两位点基因多态性收集179例SLE患者和168例健康对照者的肝素抗凝血,用血液基因组提取试剂盒抽取外周血DNA,用PCR扩增含有Tim-4基因-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位点的600bp基因片段,然后将PCR产物送到公司纯化并测序。测序结果经Blast比对分析,确定-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位点的基因型,计算基因型及等位基因频率。5.统计学分析运用GraphPad Prism5软件来对实验数据进行了Mann-Whitney非参数U检验、one-way ANOVA分析和Spearman相关性分析。采用SPSS13.0软件包进行Hardy-weinberg平衡定律和卡方检验。认为P<0.05有统计学意义。结果1.SLE患者外周血细胞凋亡水平显著高于健康对照组,而且细胞凋亡率与补体3(C3)呈负相关,与SLE疾病活动度(SLEDAI)呈正相关。流式结果显示,SLE患者外周血Annexin-V/PI双标中Annexin-V+细胞的百分率即细胞凋亡水平(31.14%±11.3%)显著高于健康对照组(17.57%±6.94%)(P<0.0001).经Spearman相关性分析,发现SLE患者外周血细胞凋亡水平与C3水平呈良好负相关(P=0.0171,r=-0.5692),与SLEDAI评分呈正相关(P=0.0408, r=0.3635),与dsDNA和C4没有相关性。高水平的抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、低水平的C3、C4和疾病活动性相一致。2.SLE患者外周血CD14+细胞上Tim-3的表达水平在疾病活动期(SLEDAI>5)高于健康对照组,且与anti-dsDNA呈正相关。流式结果显示,处于活动期的SLE患者(SLEDAI>5) CD14+细胞上Tim-3的表达水平(58.62%±19.58%)显著高于健康对照组(41.96%±21.97%)(P=0.0265)。但是在疾病非活动期CD14+细胞上Tim-3的表达水平与健康对照组以及疾病活动期都没有明显差别。另外,SLE患者CD14+细胞上Tim-3的表达水平与anti-dsDNA成正相关(P=0.0471,r=0.4379),与C3、C4和SLEDAI评分没有相关性。3.SLE患者外周血细胞凋亡水平与CD14+细胞上Tim-3的表达水平呈正相关。流式细胞术检测结果显示,SLE患者外周血细胞凋亡水平与CD14+细胞上Tim-3的表达水平呈良好正相关(P=0.0338,r=0.3762)。4.SLE患者外周血PBMC Tim-4mRNA表达水平与临床指标无明显的相关性。SLE患者中外周血PBMC Tim-4mRNA表达水平与凋亡水平、anti-dsDNA、C3、C4、 SLEDAI评分并没有相关性。5.Tim-3和Tim-4促进HEK293T细胞对凋亡细胞的吞噬。将pcDNA3.0-Tim-3和pcDNA3.0-Tim-4转染HEK293T细胞后并与凋亡的胸腺细胞共孵育,与转染pcDNA3.0的HEK293T细胞的吞噬率(6.4%)相比,发现Tim-3和Tim-4能够明显促进HEK293T细胞对凋亡细胞的吞噬作用(Tim-3:15.8%; Tim-4:14.0%).6.Tim-4基因-1419(rs6874202)位点为GG基因型的SLE患者dsDNA水平和外周血细胞凋亡水平分别显著高于GA/AA和GA基因型,而GG基因型的患者C3水平显著低于AA基因型。测序结果显示,SLE患者和健康对照组Tim-4-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位点基因型分布和等位基因分布没有差别。Tim-4-1419(rs6874202)位点GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA显著高于GA及AA基因型的患者(P=0.0335),而GG和GA基因型的SLE患者C3水平显著低于AA基因型(P=0.0187),另外,发现AA和GG基因型的SLE患者细胞凋亡水平显著高于GA基因型的患者(P=0.0393)。结论1.SLE患者细胞凋亡水平明显高于对照组,CD14+细胞上Tim-3的表达水平在疾病活动期高于健康对照。2.SLE患者外周血细胞凋亡水平与C3呈负相关,与SLEDAI评分呈正相关,患者CD14+细胞上Tim-3的表达水平与anti-dsDNA及细胞凋亡水平呈良好正相关,提示Tim-3分子可能与SLE患者的凋亡细胞清除障碍有关。3.中国人群中存在Tim-4基因启动子区-1419/-1609G/A突变,且-1419位点GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA和凋亡水平分别显著高于GA/AA和GA基因型的患者,而GG基因型的患者C3水平显著低于AA基因型,虽然未发现Tim-4基因启动子区-1419/-1609位点SNP与SLE发生的相关性,但是-1419位点的GG基因型可能会影响SLE的病程进展和预后。创新点及意义本研究首次发现SLE患者外周血CD14+细胞上Tim-3的表达在疾病活动期显著上调且与anti-dsDNA、外周血细胞凋亡水平呈正相关,为Tim-3分子参与SLE的发病机制研究提供了新的依据和切入点。另外,发现Tim-4基因-1419位点GG基因型影响SLE疾病的活动度,提示Tim-4基因-1419位点为GG基因型的SLE患者预后较差。该研究结果为SLE的干预策略提供了新的靶点。