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1.研究背景与目的我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染的高发区域,有约50%的人口曾经感染过HBV,目前仍约9300万慢性HBV感染者。HBV可引起不同的临床结果,包括有隐匿感染、急性乙肝、慢性乙肝、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌等,严重危害人类健康。至今,乙型肝炎的发病机制仍未完全阐明。大量研究结果表明HBV感染的清除和病理损伤主要决定于机体的免疫应答状态,感染的病毒通过激发免疫反应间接引起肝细胞损害。在针对HBV的免疫应答反应中,特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)在清除病毒和决定疾病转归中发挥重要作用。在急性乙型肝炎患者体内存在较强的多克隆CTL反应,HBV很快能清除,而慢性乙型肝炎患者的外周血中往往CTL反应很弱或针对的病毒抗原表位单一,导致不能完全清除HBV；同时,CTL反应也与免疫病理损伤的程度和类型相关。引起这种HBV特异性CTL反应差异的机制目前尚不完全清楚,可能与机体(如炎性因子基因多态性、HLA亚型及CTL细胞本身)和病毒(如病毒变异和病毒载量)有关。CTL的特异性取决于细胞表面的T细胞受体(T cell receptor, TCR)而TCR的特性主要决定于α和β链可变(V区)区的分子组成,因此,揭示特异性CTL的TCR分子的组成特点对深入理解HBV免疫应答反应机制十分重要。本研究从分析乙型肝炎患者在疾病进展不同阶段的外周血CTL表达频率入手,进而分析乙型肝炎患者HBV抗原表位特异性CD8+T淋巴细胞TCRα和β链的取用特点,并找到可配对的α和β链基因,构建到特异性质粒中,在特定细胞中人工表达TCR分子,为进一步研究CTL的功能,帮助阐明乙型肝炎患者特异性细胞免疫应答的特点及其分子机制和乙型肝炎的免疫治疗提供帮助。2.材料与方法(1)研究对象为2008年1月至2010年12月在我们医院(解放军第302医院)住院的40例急性乙型肝炎患者和40例慢性乙型肝炎患者,另有15例名健康志愿者作为正常人对照。诊断标准参照2000年9月(西安)全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准,排除甲型肝炎、丙型肝炎戊型肝炎及药物、自身免疫因素等重叠引起肝功损害的因素。(2)采集40例急性乙型肝炎患者、40例慢性乙型肝炎患者和15例正常人血样进行HLA-A2检测。HLA-A2阳性的患者及正常人(18例急性乙肝患者、18例慢性乙肝患者、6例正常人)均提取外周血单个核细胞(其中急性乙肝患者取急性期和恢复期两份血样),另选取6例HLA-A2阴性的急性乙型肝炎患者亦提取外周血单个核细胞。经CD3、CD8和HBV多肽抗原(HBsAg183-191, HBsAg335-343特异性五聚体荧光染色,分析特异性CD8T细胞频率。(3)急性乙肝患者中18例为HLA-A2阳性,取患者血样提取基因组DNA扩增HLA-A基因座基因,通过胶回收后测序,通过DNA序列测定确定HLA-A2亚型。患者的HBV DNA载量、HBV抗原抗体5项和生化检测解放军第302医院临床检验医学中心完成。(4)HLA-A2阳性急性乙肝患者中,取6例患者PBMC,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养3-4周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA 5’末端快速扩增技术(5’RACE)获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。通过Vector NTI等软件和IMGT/PhyloGene网站对所获序列结果进行分析。确定TCRα链、p链基因家族并比较CDR3区序列特点。(5)确定构成TCR分子的α链、β链分子配对,应用cDNA 5’末端快速扩增技术(5’RACE)获取两个分子的5’端,cDNA 3’末端快速扩增技术(3’RACE)获取分子的3’端,然后应用OVER-LAP PCR构建全长α链、β链分子,分别导入表达质粒SAMEN CMV/SRa中,经过包装细胞包装后,取病毒上清感染Jakurt细胞,筛选出表达特异性TCR分子的细胞,为CTL功能试验做准备。3.研究结果(1)18例HLA-A2阳性急性乙肝患者急性期HBsAg183-191的特异性CTL频率为0.23%±0.18%,HBsAg335-343为0.49%±0.31%,较HLA-A2阳性的慢性乙肝患者发病极期上述抗原的特异性CTL频率(0.07%±0.03%和0.08%±0.04%)明显升高(P<0.01)。HLA-A2阴性急性乙肝患者和HLA-A2阳性正常人均未检出上述2个抗原的特异性CTL。(2)HBsAg183-191的特异性CTL频率与ALT峰值无显著相关性(r=0.4506,P=0.0528),而HBsAg335-343特异性CTL频率与ALT水平呈正相关(r=0.5642,P=0.0119),但上述CTL频率与HBV载量无相关性。(3)对8例患者进行了外周血HBV特异性CTL频率的动态分析,患者在发病极期的CTL频率为0.75±0.42,显著高于患者在恢复期的特异性CTL频率0.42±0.30, (P=0.011)。(4)HLA-A2亚型与优势CTL表位多肽相关,HLA-A0201和A0203阳性急性乙型肝炎患者的HBsAg335-343特异性CTL频率显著高于HBsAg183-191特异性CTL频率(0.56±0.63%vs.0.21±0.27%,P=±0.0413),而HLA-A0207和A0206阳性急性乙型肝炎患者的HBsAg183-191特异性CTL频率相对较高(0.17±0.31 vs.0.33±0.47%,P=0.0749)。(5)对6例急性乙肝患者样本600多个TCRa链和β链克隆基因序列分析的结果提示,HBV特异性CTL均呈现TCR分子α链、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以2-4种α链和1-4β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和β23家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的p链基因均为β13家族。(6)同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。7、成功合成TCR分子α、β链全长基因。进一步行载体构建及包装,转染Jurkat细胞进行特异性TCR分子表达,实验仍在进行中。4.研究结论(1)HBV特异性CTL在病毒清除和肝损伤中具有重要作用,针对不同HBV抗原表位的CTL,其作用可有一定差别。(2)在急性乙肝患者中,HLA分子亚型与疾病的预后可能相关。(3)经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CTL具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。