黄喉拟水龟(Mauremys mutica)是目前我国华南地区新兴的水产养殖品种之一,具有较高的食用、药用、科研以及观赏价值。在2012年,仅广东省的黄喉拟水龟商品亲龟的养殖规模就已经突破了353万只。然而,一直以来,苗种获得量少是制约黄喉拟水龟产业发展的主要因素之一,由于黄喉拟水龟产卵数在个体之间存在显著差异,因此筛选出繁殖能力高的母本作为繁育亲本是解决苗种缺口,促进产业可持续发展的有效途径之一。本研究主要从以下六个方面探讨了影响黄喉拟水龟繁殖能力的内在因子,并从分子水平分析其产卵差异的分子机制,筛选到了与繁殖能力相关的SNP标记,为黄喉拟水龟产业可持续发展提供一些基础数据和有效的遗传信息。1、为了研究母体大小如何影响养殖群体黄喉拟水龟子代的大小和数量,我们基于四年的统计数据探讨了母体体型(腹甲长)与幼龟的数量和大小之间的关系。结果表明,不同大小的雌性产生的子代大小和数量均存在差异。回归分析结果显示,没有发现母体大小对子代的体质量存在显著效应,然而,我们检测到子代大小和窝卵数均与母体的年龄(2013-2016,实验中的雌龟同龄)显著正相关。在四年内,子代的平均体重逐渐增加,并且窝卵数大小存在显著变化。每个雌龟的子代数量随着母体腹甲长而不是年龄的增加而增加。我们的结果与最佳子代大小理论一致,即雌性并非通过增加子代大小,而是增加子代数量以增加其适应性,这进一步促进了对爬行动物的繁殖策略演变的了解。2、为了探讨生物因素(比如年龄)和非生物因素(如天气变化)对养殖龟类繁殖输出的影响,我们分别统计分析了13龄(n=261)和25龄(n=265)雌性黄喉拟水龟在无雨和有雨条件下的产卵情况,结果发现无论是否降雨,年长组雌龟产的卵都显著大于年轻组,而相较于降雨条件,母龟在无雨条件下的平均窝卵数更多。窝频率不受母龟的年龄和雨水的影响,也未检测到雨天和年龄之间的交互作用对母龟卵大小,窝卵数以及窝频率的显著效应。实验结果表明在某个生长阶段,年龄和降雨分别显著影响黄喉拟水龟的卵大小和窝卵数。研究结果为黄喉拟水龟人工繁育、亲本管理和高效养殖提供一些有用的信息。3、包括黄喉拟水龟在内的大多数产卵类动物的繁殖能力(卵或蛋的大小和多少)受到母体年龄和大小的制约,为阐明两者对母体繁殖能力的决定机制,我们首先获得了繁殖相关基因ESR1,BMPR1B和FOXL2。ESR1开放阅读框(ORF)为1767 bp,编码588个氨基酸。BMPR1B ORF为1599 bp,编码532个氨基酸。FOXL2 ORF为906 bp,编码301个氨基酸。分析产蛋期间ESR1,BMPR1B和FOXL2在不同年龄和不同大小的性成熟雌龟卵巢,脑和子宫中的表达,结果显示,ESR1在大个体母体的脑和子宫中的表达量均显著低于小个体,但是在卵巢中的表达量不受母体大小影响。ESR1在不同年龄组和不同大小组中的表达差异显著,母龄与体长之间存在交互作用。而BMPR1B在不同大小的母体的卵巢,脑和子宫中的表达量之间均无显著差异。另外,FOXL2在卵巢和脑中存在不同的表达模式。我们的研究结果暗示母体年龄和大小在调控繁殖相关基因表达过程中的复杂性和多样性,为母体特征对繁殖相关基因表达的影响提供了更多的信息。4、为探讨线粒体编码基因变异(突变和拷贝数)是否与黄喉拟水龟的繁殖能力有关,我们获得了其线粒体编码基因ND1,ND2,COX2,ND4,Cytb和D-loop等6个基因一共129个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点,探讨这些候选SNP位点在黄喉拟水龟“高繁殖力”组和“低繁殖力”组中的分布差异情况,对初步筛选到的5个候选SNP位点与83只雌龟的繁殖能力进行关联分析验证,结果显示:仅在ND1中发现3个SNP位点(C119T,A320G和A417C)与黄喉拟水龟繁殖能力显著正相关(P<0.05)。此外,我们还获得了ND1,ND4,Cytb,D-loop,COX3和ATP6在不同雌龟中的拷贝数,基于绝对定量实时荧光PCR技术,通过构建基因拷贝数(Log 10转换)与每个雌龟在4年内平均子代数的线性回归方程,我们发现只有ND4和ATP6的拷贝数(Log10转换)与雌龟的平均子代数显著正相关(P<0.05)。研究结果可为黄喉拟水龟高繁殖能力群体选育提供一些可用的遗传标记。5、为了探讨影响性激素合成的因素及性激素调控动物繁殖能力的分子机制,我们比较了高、低繁殖能力雌龟黄喉拟水龟的类固醇激素生成酶基因(P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc/Cyp11α1),细胞色素P450-17α-羟化酶(Cyp17a1),3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD),17β-羟类固醇脱氢酶3型(17β-HSD3),芳香化酶(Cyp19a1)以及5α-还原酶(5α-R))以及激素受体(促卵泡雌激素受体(FSHR),雌激素受体I型(ESR1),雄激素受体(AR)以及孕酮激素受体(PR))等基因在“下丘脑-垂体-性腺”轴中的表达差异,结果显示,StAR和17β-HSD3的表达水平在高繁殖力雌龟中的垂体、卵巢和子宫中的表达水平均极显著高于低繁殖力雌龟,但是在两组的下丘脑中无显著差异。Cyp17a1,Cyp19a1和5α-R的表达水平仅在高低繁个体的垂体中存在显著差异,在下丘脑,卵巢和子宫中无显著差异。而Cyp11α1和3β-HSD表达水平在高低繁个体的四个组织中均无显著差异。FSHR,ESR1,AR和PR在高繁个体垂体中的转录水平显著高于低繁个体,ESR1和PR在高繁和低繁母体下丘脑中的表达量也存在显著差异。此外,上述四个受体基因在高低繁个体卵巢和子宫中的表达量无明显差异。我们的工作揭示了多产和低产雌龟在激素合成调节以及基因调控方面的差异,为揭示脊椎动物繁殖能力差异背后的机制奠定了一定的基础。6、提高产卵数从而获得更多的苗种量是解决黄喉拟水龟产业发展的关键措施之一,但是关于产卵差异背后的遗传机制一直未知。MicroRNAs对于动物的繁殖能力(产卵数或者子代数)具有关键的调控作用。本研究在构建高繁殖能力和低繁殖能力黄喉拟水龟卵巢cDNA文库的基础上,利用高通量测序技术筛选与产卵能力相关的miRNAs。结果显示,分别从高低繁殖力组获得了15767494(93.98%)条和15767494(93.98%)条高质量的序列。通过与黄喉拟水龟的基因组比对,筛选到131个在高低繁殖力组中差异表达的miRNA,其中78个表达量上调,53个表达下调。对差异表达的miRNAs靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,结果表明,与ATP结合以及蛋白水解相关的基因富集频率在高低繁殖力组之间存在显著差异,而三羧酸循环以及胰高血糖素信号通路和维生素B6代谢通路可能在决定繁殖能力方面发挥重要作用。利用qRT-PCR对筛选到的10个miRNAs进行验证,从侧面证实了测序结果的可靠性和准确性。这些结果有助于进一步了解miRNA对产卵行为的调节机制,为筛选并构建高繁殖能力群体提供了良好的遗传标记资源。