纹状体是基底神经节环路信号的传入及整合中心,其在调节机体运动功能中发挥重要的作用。来自皮层以及下丘脑的信号传入,经过纹状体局部环路后传出到苍白球或者黑质网状部。纹状体功能的异常与许多运动功能障碍疾病相关,如帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD),亨廷顿舞蹈症(Huntington’s Disease,HD)以及多动症(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)等。纹状体中包含有五种神经元,占比95%的中等棘状神经元(Medium Spiny Neurons,MSNs),占比1-3%的胆碱能中间神经元(Cholinergic Interneuron,Ch Is)以及剩下的g-氨基丁酸能(g-aminobutyric acid,GABAergic)中间神经元(其分别包括表达细小白蛋白,神经肽Y以及钙网膜结合蛋白的中间神经元)。已有文献报道Ch Is具有自发放电特性,其是纹状体内唯一能合成乙酰胆碱(Acetycholine,ACh)的神经元,其通过自身合成并释放的ACh来调节纹状体传出神经元MSNs的生理活动,从而参与机体运动功能的调控。毒蕈碱型胆碱受体(Muscarinic acetycholine receptor,m ACh R)广泛分布在纹状体内,在Ch Is上亦有大量表达,而其是否作为自身受体受体参与对Ch Is的调节过程尚不明确。HCN通道(Hyperpolarizationactivated Cyclic Nucleotide-gated channels)是一种超极化激活的环核苷酸门控的非选择性阳离子通道,特异性高表达在外周心脏组织以及脑内少数核团。HCN通道电流(hyperpolarization-activated current,Ih)又叫起搏电流,其参与调控神经元兴奋性以及自发节律的过程。Ch Is电生理记录到大幅度的Ih,而其所表达的通道亚型尚不明确。本研究的实验目的是阐明Ch Is胞体所表达的M受体以及HCN通道亚型,探究外源性M受体激动剂及其自身合成并释放的ACh是否能够通过自身M胆碱受体来影响HCN通道进而调节Ch Is的生理活动,并阐明其调节作用的生理机制。结果如下:1,我们结合细胞形态学,电生理学,免疫组织化学,单细胞RT-PCR技术(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,sc RT-PCR)确证我们选择的每个神经元是Ch Is。细胞形态学观察发现Ch Is具有30-50mm的胞体直径以及粗而壮的神经元突起,电生理学发现Ch Is具有特有的标志性的电生理活动,sc RT-PCR以及免疫组化发现Ch Is特异性表达胆碱乙酰转移酶(Cholineacetyltransferase,Ch AT)。2,注入去极化的电流能够诱发Ch Is规律性放电,撤去电流后细胞发生后超极化。超极化的电流能够诱发细胞膜电位超极化,并产生sag。在脑片中,绝大多数神经元都具有自发放电特性。Ch Is有三种自发放电模式,规律性放电,不规律性放电以及爆发式放电。这三种放电模式在一定程度上会发生相互转化。3,电生理学研究发现Ch Is能够记录到明显的Ih,其能够被HCN通道阻断剂ZD7288(30mM)以及Cs+(1 m M)分别阻断94.50%±0.99%(n=7)以及90.74%±1.13%(n=5)。HCN通道在Ch Is自发放电过程中发挥重要的作用,在加入HCN通道阻断剂ZD7288(30mM)后,细胞出现不连续的超极化过程。这种超极化不受TTX敏感的Na+通道调节。加入ZD7288后,细胞自发放电频率由2.44±0.71 Hz减小到1.72±0.48 Hz。Ch Is自发放电模式由规律性放电转变成爆发式放电并诱发神经元振荡放电,描述神经元放电规律性的变异系数(CV)由0.46±0.16增大到2.67±1.46。4,采用sc RT-PCR研究发现,HCN的四种亚型在Ch Is上均有转录。其中HCN2以及HCN3在每一个检测(27/27)的Ch Is中均检测到。HCN4在检测的神经元中的转录比稍微低一些(26/27),而HCN1的转录比则最低,仅为11/27。半定量RT-PCR结果表明HCN2,HCN3,HCN4的检测阈值均符合高斯分布拟合,而HCN1由于含量太低不能采用高斯曲线拟合。结果表明,HCN2的中心检测阈值为2-5而HCN3以及HCN4的检测阈值都为2-3。免疫荧光化学实验结果证明,在蛋白水平上HCN2高表达,而HCN1信号则很弱。以上实验结果表明,在Ch Is细胞上HCN2是主要表达的HCN通道亚型。5,电生理学研究表明,外源性添加非选择性胆碱受体激动剂ACh?Cl(50μM)能够明显抑制Ch Is神经元的自发放电。细胞放电频率由fcontrol=1.88±0.44 Hz减少为fACh·Cl=1.13±0.38 Hz(n=6,p<0.05)。描述放电规律性的变异系数CV值由给药前的0.38±0.14增大到给药后的0.54±0.20(n=6,p<0.01)。M胆碱受体激动剂OXO-M也同样抑制Ch Is神经元的自发放电,放电频率由fcontrol=1.62±0.67 Hz减小为fOXO-M=0.93±0.35 Hz(n=11,p<0.01)。CV值同样由给药前的0.41±0.09增大到给药后的0.65±0.13(n=11,p<0.001)。加入OXO-M后,Ch Is细胞的超极化时间明显延长。加入M胆碱受体拮抗剂SCO后细胞的自发放电频率没有发生明显的变化(fcontrol=1.75±0.61 Hz,f SCO=2.31±0.91 Hz,n=9,p>0.05)。在SCO与OXO-M共同给药时,OXO-M对Ch Is的抑制作用被阻断(fcontrol=1.75±0.61 Hz,fSCO+OXO-M=2.35±1.10 Hz,n=9,p>0.05)。细胞的放电模式没有被改变,CV值在加入SCO以及SCO与OXO-M共同作用时均没有发生明显的变化(CVcontrol=0.38±0.08,CVSCO=0.35±0.05,CVSCO+OXO-M=0.37±0.09,n=9,p>0.05)。这些结果表明激活M胆碱受体抑制Ch Is细胞的自发放电过程。6,文献报道M受体能够调节许多离子通道从而影响细胞的生理活性。本研究发现OXO-M能够显著抑制Ih。这种抑制作用与时间以及电压呈现相关性。在-140 m V的超极化电压刺激时,Ih幅度在加入OXO-M后减小21.1%±8.5%(n=9,p<0.01)。在加入OXO-M后,HCN通道尾电流的半数激活电压从-102.4±2.11 m V超极化为-107.4±2.25 m V(n=9,p<0.01)。SCO加入后,OXO-M对Ih的作用没有时间以及电压相关性。在最大超极化电压(-140 m V)时,OXO-M对Ih的抑制作用被SCO阻断(99.2%±0.03%of control,n=5,p>0.05)。SCO本身对Ih幅度以及HCN通道尾电流的半数激活电压没有明显的作用,共同加入SCO时,OXO-M对Ih的半数激活电压没有向超极化方向改变(V1/2 in control,-105.7±2.23 m V;V1/2 in SCO,-104.0±1.76 m V;V1/2 in SCO+OXO-M,-104.5±2.50 m V;n=5,p>0.05)。以上结果表明OXO-M是通过激活M胆碱受体来间接改变Ih幅度以及HCN通道的动力学性质。7,为了确证是哪种M胆碱受体参与OXO-M对HCN通道的抑制作用,我们首先采用sc RT-PCR阐明M受体亚型的表达。结果表明,在Ch Is胞体上五种M胆碱受体均有转录。统计学分析表明,M2在每一个(32/32)检测的神经元中均有转录,而M4在检测的神经元中有20/32检测到转录。M1样胆碱受体(M1,M3,M5)在检测的Ch Is中的转录比分别为28/32,18/32,26/32。半定量RT-PCR研究表明,M1及M2的检测稀释阈值能够用高斯分布曲线拟合,M1的检测阈值为2-3而M2的检测阈值2-8。M3,M4,M5由于含量较低,其分布曲线不符合高斯分布而无法拟合出其检测阈值。同样在蛋白水平的免疫荧光化学实验证明相对高转录的M2受体在Ch Is细胞上高表达,而M4受体免疫荧光信号则相对很弱。综上,M2受体是Ch Is细胞上相对高表达的M胆碱受体亚型。8,电生理实验表明Ch Is细胞上的Ih对c AMP高度敏感,在加入c AMP类似物后8-Br-c AMP(100μM),Ih幅度增大为给药前的126.8%±8.0%(n=4,p<0.01)。在加入c AMP竞争性拮抗剂Rp-c AMP(50μM)后,Ih幅度明显减小(82.6%±4.5%of control,n=4,p<0.01)。在加入M2样受体拮抗剂AF-DX384(1μM)后,Ih没有发生明显的改变(97.0%±3.8%of control,n=8,p>0.05)。继续加入OXO-M(10μM)后,Ih也没有发生明显的变化(94.3%±5.5%of control,n=6,p>0.05)。在加入G蛋白的阻断剂GDP-β-S(0.5μM)后,OXO-M对Ih的抑制作用被阻断(95.4%±7.3%of control,n=7,p>0.05)。c AMP依赖的蛋白激酶阻断剂H-89对Ih没有明显作用(96.2%±5.5%of control,n=7,p>0.05),而当OXO-M与H-89共同加入浴液中时,OXO-M对Ih的抑制作用并没有被明显的影响(84.4%±3.8%of control,n=11,p<0.01)。以上实验结果表明OXO-M对HCN通道的抑制作用是通过不依赖于PKA蛋白激酶的c AMP信号通路而发挥作用的。9,在诱发放电状态下(I=0.06 n A),实验结果表明加入SCO(30μM)后细胞放电频率明显增加,由基础状态的3.14?0.46 Hz增加到给药后的4.30?1.37 Hz(*p<0.05,n=7)。变异系数CV值由给药前的0.89?0.18减小为给药后的0.72?0.12(*p<0.01,n=7)。这个结果表明在自发状态下,Ch Is释放的ACh浓度较低而没有表现出明显的自身调节作用。本研究结果表明Ch Is细胞上表达有四种HCN通道亚型以及五种M胆碱受体亚型,其中HCN2以及M2为主要表达的亚型种类。HCN通道在调节Ch Is细胞自发放电过程中发挥重要的作用,其主要通过调节Ch Is超极化的时程来影响Ch Is的自发放电频率。激活Ch Is胞体上的M胆碱受体能抑制Ch Is细胞的自发放电,其主要通过胞膜上的M2样受体介导。M受体通过c AMP信号通路调节胞内的c AMP浓度来调节HCN通道活性,从而调节Ch Is的自发放电活性。在基础状态下,脑片内的Ch Is细胞自发释放的ACh浓度较低,加入SCO阻断后脑片记录不足以观察到其自身的调节作用。诱发放电状态下,细胞的释放的ACh增多,其自我调节作用增强,加入SCO后能观察到明显的生理活动变化。本研究结果表明Ch Is自身表达的M受体能够通过调节HCN通道来改变Ch Is细胞的电生理活动,这为阐明M受体在机体内参与运动功能的调控提供一个新的角度。