白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18）是新近克隆的白细胞介素家族的最新成员，是IFN-γ的强诱导因子，在Th1型免疫应答中具有重要作用。采用逆转录PCR从人单核细胞系THP-1中获得了人成熟IL-18 （hIL-18）cDNA，测序鉴定正确的片段经EcoR I/BamH I酶切后克隆入原核表达载体pBV220，再转化至大肠杆菌DH5α高效表达，经纯化获得了有活性的重组hIL-18蛋白。 白细胞介素18（Interleukin 18， IL-18）是Okamura等1995年从热灭活的Propionibacterium acnes（痤疮丙酸杆菌）和LPS联合处理过的小鼠肝脏提取物中分离纯化并克隆到的一种IFN-γ诱导因子，起初发现其具有诱导T细胞产生IFN-γ，因此曾叫γ干扰素诱导因子（Interferon－gamma－inducingfactor，IGIF），是调节Th1细胞功能的新型细胞因子，其生物学作用与IL-12有许多相似之处。IL-18主要由单核巨噬细胞产生，以单体形式发挥作用，能诱导T细胞产生IFN-γ，促进NK细胞杀伤治性，与IL-12具有协同作用；并能促进T细胞分泌IL-2和GM-CSF，抑制其产生IL-4和IL-10。IL-18在感染炎症、自身免疫性疾病等过程中起重要作用，对其的研究可能有助于感染、肿瘤、过敏性疾病等的治疗。IL-18能激发Th1型免疫应答，在感染炎症、自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤等病理过程中起重要作用，对其的研究可能有助于这些疾病的治疗。 人和小鼠的IL-18主要是由巨噬细胞样细胞产生，如单核巨噬细胞，肝 博士论文《白细胞介汞18的重组表达及其抗肿泊作用的研究》 中的Kllpffer细胞等。Okam。a等冈发现小鼠几l主要来源于P．acnes处理小 鼠的Kllpffer细胞，但P．acnes诱导的腹腔贴壁细胞也有IL＊ InRNA的表达。 小鼠单核细胞，巨噬细胞可自发表达ILl InRNA，单用LPS虽不能刺激上 述细胞产生ILd，但能促进其IImNA的表达。R上 分子没有信号肽，但 前体无活性。小鼠IL＊ cDNA全长大小约为 1．Ikbp，编码 192aa的前体，分 子量约为 18．3 kDa，包含由 35aa组成的特殊的引导序列，缺乏传统的信号序 列，其成熟态为 156aa，是在”Asp“Asn之间由n4 转化酶（ICE）酶切所致 ［”’］。人IL4 全长。DNA编码193aa的前体，分子量约为18．3 kDa，包含由 36aa组成的特殊的引导序列，缺乏传统的信号序列，其成熟态为157aa，是 在“Asp’＊yTH间由n上 转化酶OCE）酶切所致。nd分子没有N－糖基化 位点及可能的疏水信号肽，以单体形式发挥作用，虽然有4个CyS，但无二 硫键形成。最近，Konishi等［‘l建立了用人的髓样单核细胞系KG＊直接进行 人ILd生物学活性检测的方法。 一．人白细胞介素18的基因克隆与原核表达 采用RTFCR，我们从人单核细胞THP上中克隆了人白细胞介素 18uL 18）对应于成熟蛋白分子的编码 cDNA，经测序鉴定后在大肠杆菌中高效 表达和纯化了有活性的人ILIS。我们在设计PCR引物时去掉了人ILq 的引 导序列，同时也去掉了其cDNA的3’端非编码区。在编码成熟人IL上第一 个氨基酸的密码子前加了起始蛋氨酸的密码子，保证其在大肠杆菌中的原 核表达。由于采用了高效的双酶切定向克隆，很容易地得到了阳性的重组 子。我们获得的克隆与文献报道一致。 将人几l8 cDNA克隆至原核表达载体pBV220的EcoRI和BalnHI位点，使 IL1 CDNA置于P少启动子的控制之下，在启动子上游有温度敏感的转 录遏制物CIts857存在，在热诱导条件下去遏制，使得几l 基因开放表达。 将重组子导入大肠杆菌DH5a，建立人n4 原核表达的工程菌，并对工程 菌的形态学、革兰氏染色特征、质粒遗传稳定性和靶蛋白表达水平的稳定 3 博士论文《白细胞介素18的重组表达及其抗肿疤作用的研究》 性等进行了分析鉴定，表明所建立的人fi上工程菌具有较好的稳定性。该 工程菌在42 oC热诱导条件下，表达的人几4 以包涵体形式存在，约占菌体 总蛋白的 15％左右，在 10L体积的发酵罐中能稳定地大规模发酵表达，表 明该工程菌可以用于大规模的中试生成。 通过提取表达工程菌的包涵体、溶解包涵体、凝胶过滤柱层析、复性 和反相高压液相柱层析等纯化工艺，最终得到了重组人几l8的纯品，纯 度高达95％以上。对所纯化的重组人ILl进行Mes饶rn印迹杂交的免疫学 检测和刺激IFNry产生的生物学活性检测，结果表明我们所纯化的重组人 几刁8不仅纯度高，而且具有较好的生物学活性。该部分的研究建立了原 核重组表达人几八