1999年美国Iowa大学Maniotis等在研究葡萄膜黑色素瘤微循环时发现恶性肿瘤细胞表型可出现转化，通过自身变形直接形成脉管并与宿主血管相连，称之为血管生成拟态(vasculogenicmimicry)。血管生成拟态使得少数高度恶性肿瘤如卵巢癌、肝癌等极易侵袭和转移，使得抗肿瘤血管治疗无法彻底阻断肿瘤血供，不能有效改善患者5年生存率。目前关于癌细胞内皮样逆转及管道重塑机制等问题还不清楚，已成为寻找肿瘤抗血管治疗突破的重要理论障碍。缺氧(hypoxia)是经典肿瘤血管生成(angiogenesis)的主要诱因，因此缺氧也极有可能是血管生成拟态的重要诱因，目前国内外尚未见相应研究的报道。 本研究拟通过三维培养，探讨缺氧对卵巢上皮性癌细胞生成拟态血管的诱导作用；对肿瘤细胞诱导的内皮样细胞进行鉴定，寻找卵巢上皮性癌(TSC)的线索；探讨缺氧对卵巢癌细胞增殖、细胞周期分布、凋亡、侵袭等生物学行为的影响；研究缺氧诱导因子1在卵巢上皮性癌细胞(或TSC)向内皮样细胞分化中的调控作用。 第一部分缺氧诱导卵巢癌血管生成拟态三维重构及血管内皮样细胞的鉴定1.1方法建立Metrigel三维培养系统，在1％O2缺氧条件下，对卵巢上皮性癌细胞SKOV-3和ES-2进行缺氧诱导，相差显微镜和扫描电镜观察拟态血管形态；同时应用免疫荧光双重标记、透射电镜等技术对肿瘤内皮样细胞的表面特异性抗原、超微结构和acLDL吞噬功能进行鉴定。 1.2结果缺氧可以诱导卵巢癌细胞SKOV-3和ES-2转化为内皮样细胞，并形成腔样、管状、分支和网络状等拟态血管。 SKOV-3内皮样细胞可以表达Flk-1，AC133，vWF；细胞出现空泡样变，表面出现微绒毛样突起，极少数细胞出现质膜包裹的颗粒。 ES-2内皮样细胞可以表达Flk-1，CD34；细胞出现空泡样变，表面出现微绒毛样突起，极少数细胞出现质膜包裹的颗粒；部分细胞局部胞浆出现Dil阳性细胞，具有吞噬acLDL功能。 在常氧、缺氧同时应用西洛莫司条件下，SKOV-3和ES-2细胞均不能观察到上述改变。 1.3结论缺氧是卵巢上皮性癌血管生成拟态的主要诱导因素之一，西洛莫司在体外具有遏制缺氧诱导卵巢癌细胞形成拟态血管的作用。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞可能来源于卵巢上皮性肿瘤细胞中的干细胞，在缺氧的压力下，向内皮细胞(EC)分化的一种肿瘤源性EC前期细胞，能表达部分EC的特异性抗原、具有EC超微结构的雏形、可有吞噬acLDL功能。 第二部分缺氧对卵巢上皮性癌细胞增殖、凋亡、侵袭及分化的调控2.1方法在三维培养条件下，应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)、FCM和Transwell小室等技术检测缺氧条件下卵巢上皮性癌细胞SKOV-3和ES-2的增殖、细胞周期分布、凋亡、侵袭。激光显微切割将SKOV-3和ES-2内皮样细胞分离后，应用TRAP和实时定量RT-PCR技术检测肿瘤内皮样细胞、肿瘤细胞和HUVEC细胞等的端粒酶活性，以及HIF-1α、CyclinD1、VEGF、Flk-1、V-src、p53等基因的转录水平。 2.2结果缺氧3天SKOV-3增殖受到显著抑制(P＜0.01)，缺氧7天和常氧时无显著性差异；而缺氧3天和7天ES-2增殖均和常氧时无显著性差异。缺氧3天SKOV-3和ES-2细胞周期在G0～G1期(P＜0.01)，S期(P＜0.05)，G2～M(P＜0.01)期分布均发生显著性改变；缺氧7天两者在S期分布和常氧时均无显著性差异。缺氧3天SKOV-3和ES-2凋亡率显著上升(P＜0.01)；缺氧7天两者和常氧时均无显著性差异。缺氧3天和7天SKOV-3穿过滤膜的细胞数均显著少于常氧时(P＜0.01和P＜0.05)；缺氧3天ES-2细胞穿过滤膜的细胞数显著低于常氧时(P＜0.05)。 SKOV-3内皮样细胞端粒酶活性表达为阳性；常氧时、缺氧加入西洛莫司时SKOV-3粒酶活性表达为阳性。缺氧7天ES-2内皮样细胞端粒酶活性表达为阴性，加入西洛莫司时ES-2也为阴性；常氧时ES-2细胞端粒酶活性表达为阳性。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞HIF-1αmRNA的表达显著高于常氧时表达(P＜0.05)和西洛莫司处理后SKOV-3和ES-2的表达(P＜0.05)；也显著高于HUVEC的表达(P＜0.05或P＜0.01)。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞VEGFmRNA的表达显著高于常氧时表达(P＜0.05)和西洛莫司处理后SKOV-3和ES-2的表达(P＜0.05)；均显著低于HUVEC的表达(P＜0.05或P＜0.01)。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞Flk-1mRNA的表达显著高于常氧时SKOV-3和ES-2的表达(P＜0.05)；均显著低于HUVEC的表达(P＜0.05或P＜0.01)；ES-2内皮样细胞显著高于西洛莫司处理后的表达(P＜0.05)，而SKOV-3无显著性差异。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞CyclinD1mRNA的表达显著低于常氧时SKOV-3和ES-2的表达(P＜0.05或P＜0.01)；和HUVEC的表达以及西洛莫司处理后的表达无显著性差异。 SKOV-3和ES-2内皮样细胞p-53mRNA的表达显著高于常氧时SKOV-3、ES-2和HUVEC的表达(P＜0.05或P＜0.01)；和西洛莫司处理后的表达无显著性差异。 缺氧和常氧状态下SKOV-3和ES-2各种细胞均不表达V-srcmRNA，无显著性差异。 2.3结论EC对缺氧的耐受和适应能力低，构成某些高度恶性肿瘤不得不寻找其他血管生成途经的外界压力，是肿瘤VM形成的理论依据之一。 SKOV-3和ES-2细胞在增殖、凋亡、侵袭等方面对缺氧均存在耐受和适应；肿瘤细胞分化程度越低，其耐受与适应缺氧的能力越强，越易生存，越有可能形成拟态血管。 缺氧诱导ES-2细胞向ES-2内皮样细胞分化过程中，HIF-1α通过调节端粒酶的活性而起作用。 在VM形成过程中，SKOV-3和ES-2细胞通过自分泌途经，高表达VEGF和Flk-1，刺激肿瘤细胞向内皮样细胞横向分化，该途经是受HIF-1α调控。 CyclinD1在调控SKOV-3和ES-2向内皮样细胞分化过程中具有重要的作用，这种调控作用不是通过HIF-1α进行。 SKOV-3和ES-2向内皮样细胞转化后，原有的恶性肿瘤细胞属性降低或丧失。 西洛莫司在体外能有效遏制卵巢癌拟态血管形成，主要通过阻断HIF-1α介导的肿瘤细胞VEGF自分泌作用，使癌细胞不能被诱导分化为内皮样细胞；同时通过非HIF-1α氧反应通路而具有抗肿瘤作用。