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生物被膜(biofilm)是细菌附着在介质表面,通过分泌大量的多糖、脂质、蛋白质以及DNA等胞外多聚物将自身包裹黏连而形成的多细胞群体。它是一种区别于浮游态细菌的独特生存形式,位于生物被膜内的细菌对宿主免疫系统、抗生素和消毒剂等不利于生存的环境表现出极强的抗性。已知生物被膜与80%的慢性感染有关,在工业生产中也会引起食品安全、生物腐蚀和生物淤积等问题。生物被膜的分散是细菌形成生物被膜的最后一个环节,受到诸如环境因素、胞内或胞外信号分子以及效应蛋白等复杂信号网络的调控,对细菌趋利避害、个体增殖以及侵染宿主具有重要意义,研究其调控机制有助于研发新的生物被膜防治方法,更有效地进行生物被膜的干预和清除。 最近,大肠杆菌中的蛋白BdcA被发现可直接介导生物被膜的分散。BdcA是短链氧化还原酶(SDR)家族成员,能够特异性地结合NADPH分子。目前,BdcA已被作为分子机器应用于分散多种革兰氏阴性菌产生的生物被膜,是微流控设备等工业装置的重要组成部分,并且还可以促使“有益的生物被膜”形成以便减少生物淤积。然而,关于BdcA如何调控生物被膜分散的机制尚不清晰,相关方面的报道也极为缺乏。 本论文以BdcA蛋白为研究对象,解析了BdcA-NADPH和BdcA-NADPH-底物类似物(X)的三维结构。通过结构分析,明确了BdcA的催化活性中心以及潜在的底物结合口袋。利用定点突变、ITC、酶活力测定等生化方法鉴定了催化活性中心和底物结合的关键位点,进一步用基因敲除和回补的方法对这些关键位点在细菌运动和生物被膜分散中的作用进行了检测,得出以下结论:一、Ser132、Tyr146和Lys150组成的催化三联体是BdcA结合辅酶NADPH的关键位点,与其催化活性密切相关;二、NADPH的结合固定了一些水分子,为BdcA在催化时实现质子传递提供了条件;三、BdcA结合NADPH后,其C端构象发生变化,形成了含有大量疏水残基的潜在底物结合口袋,同时该口袋也是NADPH进出的通道;四、NADPH与底物的结合是BdcA促进细菌运动和生物被膜分散的必要条件,二者在BdcA发挥功能过程中缺一不可。 综上,本文的研究为揭示以NADPH为辅酶的短链氧化还原酶BdcA调控细菌运动和生物被膜分散的分子机制提供了坚实基础,帮助人们进一步理解了SDR家族蛋白在生物被膜调控过程中的作用,为更好地利用BdcA这类分子工具治疗细菌生物被膜引起的疾病和防治生物被膜在工业生产中产生的生物淤积等问题方面提供了科学基础。