胃癌(Gastric cancer)是我国常见的恶性肿瘤之一,发病率在消化道肿瘤中居首位。目前临床上诊治的胃癌多以进展期为主,即使进行了根治性的外科手术治疗,术后的复发转移率仍然很高,尤其是胃癌术后的腹膜转移。辅助性化学治疗使胃癌患者的5年生存率和生存质量有了一定的改善,但是目前的化疗药物主要针对的是处于分裂期的肿瘤细胞,而处于休眠状态的肿瘤细胞却无法消除,而这些细胞正是肿瘤术后复发、转移的关键。20世纪70年代人们开始注意到肿瘤细胞在增殖和分化等方面与干细胞具有很多相似的地方,并提出了肿瘤是一种干细胞疾病的理论,这一理论改变了人们对肿瘤的认识,为肿瘤的研究开辟了新的探索方向。肿瘤干细胞(Cancer stem cell, CSC)学说认为:肿瘤是由正常的干细胞或比较原始的细胞转变而来,相似的信号通道调节着干细胞及肿瘤细胞的自我更新。肿瘤细胞中存在着一小群具有极强自我更新能力的肿瘤干细胞,它们在驱动着肿瘤的形成,并在肿瘤的转移方面起着重要的作用。近十几年来,人们相继从脑胶质瘤、乳腺癌、肝癌、头颈部癌、结肠癌、胰腺癌等实体肿瘤中分离并鉴定出了肿瘤干细胞,并对其生物学特性、信号通道的调控、基因特征进行了研究,极大地完善了肿瘤干细胞学说。由此,肿瘤干细胞理论逐渐被大家所接受并认同。肿瘤干细胞理论进一步认为:只有杀灭肿瘤干细胞才能彻底根治恶性肿瘤。这一学说的提出为肿瘤的学研究开拓了新的方向,也对传统的肿瘤病因学说提出了新的挑战。此项实验主要建立在肿瘤干细胞理论的基础上,通过建立胃癌大网膜乳斑微转移模型,利用胃癌大网膜乳斑的独特微环境特点,探讨乳斑微转移模型在胃癌干细胞及前驱细胞研究中的意义;分析乳斑内具有干细胞特性的“成团型”微转移内肿瘤细胞的细胞生物学特性和干细胞表面标志物的表达特点,分析特异性相关表面标志物在胃癌组织中的表达与胃癌患者预后的相关性;进一步探讨胃癌干细胞的淋巴结微转移形式,比较分析胃癌细胞乳斑微转移与淋巴结微转移的共同点,进一步探讨胃癌干细胞转移的早期表现转移形式及其对早期胃癌预后的影响。第一部分:大网膜乳斑在胃癌腹膜转移中的作用目的:观察大网膜乳斑在胃癌腹膜转移过程中的作用,胃癌乳斑微转移病灶形成的特点,发生微转移的时间、特点和动态过程。材料方法:扫描电镜、透射电镜、HE染色观察乳斑的基本结构、组成。制作胃癌腹膜转移模型,体外Dil荧光染料标记615小鼠胃癌来源MFC细胞,荧光显微镜下观察计算细胞荧光标记率100%,台盼兰拒染试验显示细胞活率大于95%。取数量为1×10~4Dil-MFCs行615小鼠腹腔注射,分别于腹腔注射后4h,12h,24h,36h,48h,72h,96h,108h,7d,10d,14d, 21d(每个时间点取小鼠6只,雌雄各半)脱颈处死,避光处完整取大网膜置入福尔马林固定,免疫组化观察胃癌细胞在乳斑区和非乳斑区的不同和变化过程。结果:扫描电子显微镜观察发现乳斑区表面可见不连续的间皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞,乳斑表面散在分布大小不等的孔和间隙,透射电子显微镜观察发现乳斑区主要是由巨噬细胞构成,同时含有少量的淋巴细胞,中性粒细胞,基质细胞和少量的未成熟细胞。将一定数量的Dil-MFCs注入小鼠腹腔发现12小时后,Dil-MFCs开始大量出现在乳斑区域;腹腔注射48h,在巨噬细胞杀伤作用下,大部分胃癌细胞消除,仅有少量细胞存活,散在分布在乳斑的周围;72h后,Dil-MFCs细胞进一步减少,但可见增殖肿瘤细胞团,形成“成团型”( Cell clusters type)微转移;腹腔注射7天,乳斑区散在细胞消失,仅存在增殖肿瘤细胞团,形成显性转移。肿瘤细胞在腹腔注射72h后散在少量的出现在非乳斑区, 7天后,非乳斑区Dil-MFCs数量持续增加,未出现乳斑区Dil-MFCs细胞数量一过性减少情况,10天后,Dil-MFCs细胞量增加,但是仅形成单细胞转移,未发现细胞团。胃癌细胞腹腔注射14天后,乳斑区形成以乳斑为中心的团状转移灶,细胞增殖明显,乳斑区被肿瘤细胞占据;而非乳斑区则以单细胞转移为主,未见成团肿瘤细胞,细胞分散黏附于大网膜非乳斑区的表面。结论:1.胃癌细胞在腹膜转移的早期阶段选择性的侵犯乳斑区。2.腹腔注射72h后,乳斑内存活Dil-MFCs细胞开始增殖,形成“成团型”( Cellclusters type)微转移。3.乳斑区和非乳斑区形成不同形式的微转移,乳斑区微转移是腹膜进一步转移的基础,乳斑区微转移内肿瘤细胞不断增殖,不断释放肿瘤细胞,使乳斑转移灶成为腹腔游离肿瘤细胞的源泉,肿瘤细胞由此源源不断的释放,最终形成全腹膜转移。第二部分:胃癌大网膜乳斑“成团型”微转移中癌细胞致瘤实验目的:探讨胃癌乳斑“成团型”转移灶中是否存在胃癌干细胞,大网膜乳斑是否具有富集胃癌干细胞的作用。材料方法:选择对数生长期细胞收集,细胞活力>95%,计数后取数量为1×104MFCs行小鼠腹腔注射,于腹腔注射后72h,脱颈处死小鼠,取小鼠大网膜,置细胞培养液中吹打,用滴管仔细吹打使其成为单个细胞,离心,以有限稀释法获取不同数量的细胞(1×10~1～1×10~3)进行NOD/SCID小鼠腹壁皮下注射,每个部位0.1ml,以正常胃癌细胞作为对照组,对照组以不同细胞数量皮下注射(5×10~4～5×10~6),以上注射部位每5天检查一次,14周后脱颈处死,切取肿瘤组织,标记后,福尔马林固定,免疫组化染色。结果:皮下注射14周后,实验组小鼠全部存活,大网膜乳斑微转移灶胃癌细胞组中皮下注射数量少于5×102个细胞以下均没有肿瘤组织形成,5×10~2个细胞仅有一个部位产生肿瘤组织,直径0.4cm,而注射数量1×10~3个细胞时, 5个部位14周后均能产生肿瘤组织,肿瘤直径位于0.4cm～0.6cm之间。而对照组的正常肿瘤细胞皮下注射发现:皮下注射5×10~4个细胞仅出现一个部位的肿瘤形成,而注射部位全部出现肿瘤组织需要5×10~6个以上的细胞数量,肿瘤直径位于1.0cm～1.5cm之间)。所有切下的组织经病理检查证实为胃癌组织,实验组细胞形成的肿瘤组织经HE染色和CEA,CK20表达和对照组相比较无明显差别。结论:胃癌乳斑“成团型”微转移灶内存在胃癌干细胞;微转移团考虑是一个以肿瘤干细胞及前驱细胞为主的细胞团,乳斑内巨噬细胞杀伤作用本身是一个筛选、富集过程;乳斑微转移灶是研究肿瘤干细胞良好的动物模型;大网膜乳斑“成团型”微转移内胃癌细胞5×10~2个就具有形成肿瘤的能力。第三部分:胃癌大网膜乳斑“成团型”微转移内胃癌细胞的细胞生物学特性目的:观察胃癌乳斑“成团型”微转移灶中具有干细胞特性细胞的细胞生物学特性,筛选特异性的细胞表面标志物。材料方法:选择对数生长期细胞收集,细胞活力>95%,计数后取数量为1×10~4MFCs行小鼠腹腔注射,于腹腔注射后72h,脱颈处死小鼠,取小鼠大网膜,置细胞培养液中吹打,用滴管仔细吹打使其成为单个细胞,离心,有限稀释法获取单个细胞并观察细胞生长情况,进行软琼脂克隆形成能力的鉴定,细胞侵袭能力鉴定;RT-PCR及免疫细胞化学鉴定癌干细胞相关表面标志物CD24, CD34, CD44, CD133, CD324的表达情况。结果:干细胞表面标志物CD133表达在乳斑微转移灶胃癌细胞中明显上调7.66±0.32%,而在正常胃癌细胞中的表达为2.93±0.38%,两者比较P<0.05 ;细胞粘附分子CD324阳性表达下调,阴性表达升高14.56±1.68%,在正常胃癌细胞中的表达为4.93±0.91%。CD44阳性表达正常组为7.67±0.54%,实验组升高到16.32±0.72%,P<0.01。其他干细胞相关标志物CD24, CD34表达无统计学意义。半定量分析CD24、CD133、CD34 mRNA显示实验组与对照组无明显差异P>0.05, CD44mRNA实验组明显上调P<0.05, CD324表达明显下调P<0.01。结论:大网膜乳斑“成团型”微转移灶胃癌细胞高表达CD133、CD44,而CD324表达明显下降,CD133+、CD44+和CD324-可能为胃癌干细胞及前驱细胞的表面标志物之一。第四部分:胃癌干细胞相关标志物在胃癌中的表达及临床意义目的:观察胃癌干细胞相关标志物CD44和CD324在胃癌组织中的表达,并分析相关标志物的表达特点及其与患者预后的相关性。材料方法:选取从2000年1月-2002年12月,于大连医科大学附属一院行胃癌根治术并随访成功203例胃癌原发灶外科手术标本作为实验组,以及16例胃溃疡正常胃组织标本作为对照组,免疫组化观察CD44和CD324在胃癌组织中的表达情况,并分析CD44和CD324表达的特点及其与预后的相关性。结果:CD44在正常胃组织中呈现弱阳性表达<5%呈现棕黄色和棕褐色,表达在细胞的表面,阳性细胞多位于腺体峡部。在胃癌组织中,81.3% (165/203)的患者呈现阴性或弱阳性表达<10% ,其中阴性表达为53.7%( 109/203 ), 15.3%(31/203)患者CD44在胃癌组织中的表达< 5% , 12.3%(31/203)患者CD44在胃癌组织中的表达5～10%,12.8%(26/203)患者CD44在胃癌组织中的表达11～15%,5.9%(12/203)患者CD44在胃癌组织中的表达>15%。阳性表达率为46.3%(94/203)。CD44表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织分化程度具有相关性(P<0.05),随着肿瘤直径的增大、淋巴结的转移和分化程度的降低,CD44表达明显上调。CD44表达与病人年龄、性别、病变位置、侵润深度无相关性(P>0.05)。CD44在胃癌组织中阳性表达患者5年生存率30.9%(29/94),明显低于阴性表达患者50.5%(55/109),统计学分析P<0.05,说明CD44表达与胃癌患者预后具有相关性。但是多因素分析发现CD44表达并不是影响胃癌患者预后的独立因素P=0.081,Exp(B)=1.832。CD324在对照组正常胃组织中呈现强阳性表达。CD324在胃癌组织中的表达主要在细胞膜表面,部分伴有胞浆的表达。本组数据显示CD324强阳性表达率为63.5%(129/203),阴性或弱阳性表达为36.5%(74/203)。CD324表达与淋巴结转移具有相关性(P<0.05),而与病人年龄、性别、病变位置、侵润深度、肿瘤大小、组织分化程度无相关性(P>0.05)。CD324在胃癌组织中阳性表达患者5年生存率48.8%(63/129),明显高于阴性表达患者28.4%(21/74) ,统计学分析P<0.05,说明CD324表达与胃癌患者预后具有相关性,呈负相关。但是多因素分析发现CD324表达并不是影响胃癌患者预后的独立因素P=0.068,Exp(B)=1.646。本组病例发现:CD44与CD324表达具有相关性(P<0.001),CD44~+CD324~-表达病例49例(24.1%),CD44~-CD324~+表达81例(41.4%)。CD44~+CD324~-表达组49例患者,男性33例(67.4%),女性16例(32.6%),主要位于远端胃31例(63.7%),肿瘤直径>5cm为阳性表达率为33.3%,而<5cm阳性表达率为20.5%;浸润深度T3-4期占61.2%,低分化癌37例(75.5%),淋巴结转移阳性患者为37例(75.5%)。CD44~+CD324~-表达与淋巴结转移具有相关性(P<0.05)(表3)。CD44~+CD324~-表达病例5年生存率为24.5%(12/49),而CD44~-CD324~+表达患者5年生存率为54.8%(46/84),两组比较P<0.05。多因素回归分析显示CD44+CD324-表达是影响胃癌患者预后的独立因素P=0.005。结论:胃癌干细胞相关标志物CD44~+CD324~-表达是影响病人预后的独立因素之一。第五部分:胃癌淋巴结“成团型”微转移对pN0早期胃癌预后的影响目的:从干细胞理论的角度探讨不同的转移类型的淋巴结转移对pN0早期胃癌患者预后的影响。材料方法:对2000年1月至2005年12月间160例经病理诊断为pN0早期胃癌患者的1656个淋巴结进行免疫组化染色。对其中34例发生淋巴结微转移患者的临床资料进行回顾性分析。结果:160例pN0早期胃癌病例中34例发生淋巴结微转移(21.3%),1656个淋巴结中84个淋巴结发生转移(5.1%)。淋巴结微转移发生与肿瘤直径(P=0.041)和淋巴管浸润(P=0.008)具有相关性。34例淋巴结阳性病例中,单细胞型(Single cells type)微转移10例,成团细胞(Cell clusters type)型微转移24例。肿瘤部位、侵犯深度、肿瘤直径、淋巴管及血管浸润和分化程度均不是影响不同转移类型发生的因素。本组病例总体5年生存率是85%。单因素分析结果显示肿瘤侵犯深度(P=0.020)、肿瘤直径(P=0.035)、淋巴管浸润(P=0.018)和微转移(P<0.001)是影响病人预后的因素。淋巴结微转移患者5年生存率为55.9%,远低于无淋巴结微转移患者92.9%,P<0.001。“成团型”淋巴结微转移早期胃癌患者5年生存率为45.8%,而“单细胞型”淋巴结转移早期胃癌患者5年生存率为91.9%,两组比较P<0.001。Cox比例风险模型分析结果显示:淋巴结微转移(RR:9.925;<0.001)和“成团型”淋巴结微转移类型(RR:10.064;<0.001)是影响微转移早期胃癌患者预后的独立因素。结论:“成团型”淋巴结微转移是影响病人预后的独立因素,应该采取更积极的术后治疗措施。“成团型”淋巴结微转移可能是胃癌干细胞发生淋巴结微转移的早期表现形式之一。