第一部分 去细胞猪主动脉瓣膜支架制备方法的改进　　 金属基质蛋白酶抑制剂在去细胞瓣膜支架制备中的应用　　 目的：研究去细胞过程中瓣膜内金属基质蛋白酶(MMP)及细胞外基质(ECM)的变化,并采用新型的MMP抑制剂-Galardin来干预MMP的作用,旨在维持ECM的完整性。　　 方法：取猪新鲜主动脉瓣膜,抗生素消毒,PBS冲洗。瓣膜分为三组:组一用0.5％曲拉通和0.5％脱氧胆酸的溶液摇床震荡24小时;组二0.5％曲拉通、0.5％脱氧胆酸和84 mmol/L Galardin的溶液摇床震荡24小时,两组PBS冲洗后,于含20μ g/ml Rnase Ⅰ和200 μg/ml Dnase Ⅰ的PBS溶液作用1小时,PBS清洗备用。组三正常瓣膜作为对照组。应用常规HE和Ⅰ型胶原免疫组化染色,光镜和电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果和ECM变化。DNA含量分析,评价细胞核酸去除的效果。明胶酶谱分析观察各组间MMP的活性差别。　　 结果：HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、扫描电镜及DNA含量分析的结果均表明,经曲拉通和脱氧胆酸处理的猪主动脉瓣膜无明显细胞残余,ECM的基本结构保持完整。当加入MMP抑制剂-Galardin后,对去细胞效果、DNA含量和ECM的结构无明显影响。明胶酶谱分析结果提示单纯曲拉通和脱氧胆酸处理后的瓣膜仍有一定量的MMP残留。而当加入Galardin后,可基本抑制瓣膜中MMP的活性。　　 结论：曲拉通加脱氧胆酸钠法可以有效去除正常心脏瓣膜的细胞成分,对瓣膜结构影响较小,是一种有效的去细胞方法。该方法联合MMP抑制剂-Galardin,可抑制瓣膜中MMP的活性,以减少MMP对瓣膜ECM的破坏。　　 第二部分 骨髓基质干细胞的获取及抗体相容性实验　　 目的：探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的可行性,观察体外培养的MSC的生物学特性,分析其表型特点,检测MSC与抗CD90抗体共培养后的增殖情况,为进一步研究抗体偶联瓣膜奠定基础。　　 方法：采用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠MSC,差速贴壁结合消化控制法纯化和扩增细胞。镜下观察细胞生物学形态及生长状态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪对第3代MSC的表型检测,激光共聚焦显微镜及免疫组织化学方法检测其表面分子CD90、Ⅰ型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白(ASMA)表达。并用抗CD90抗体与MSC共培养一段时间,应用MTT试验来检测MSC的增殖情况。　　 结果：大鼠骨髓基质干细胞光镜下可见MSC呈梭形、纺锤形和多角形,核居中,有1～2个核仁。免疫荧光染色显示ASMA。免疫组织化学染色显示MSC分泌Ⅰ型胶原蛋白,长期培养未见向成骨细胞分化。在第7代以前,MSC增殖速度较快,细胞接种后1～2天为滞留期,3天后达对数生长期,第6天进入平台期。流式细胞仪检测示MSC表达CD90,不表达CD45和CD34,激光共聚焦显微镜示CD90表达于细胞表面。当MSC与抗CD90抗体共同培养24小时和48小时后,通过MTT试验所测得的平均吸光度与对照组无显差别(P＞0.05)。　　 结论：差速贴壁结合消化控制法易于分离、扩增MSC,易获得大量高纯度的MSC。在体外培养条件下细胞生长性状稳定,并阳性表达相应的细胞表面分子CD90。体外MSC与抗CD90抗体共同培养示抗CD90抗体对MSC无明显的细胞毒性作用。　　 第三部分 去细胞猪主动脉瓣的抗体表面修饰及体外实验　　 一.抗CD90抗体偶联去细胞猪主动脉瓣的制备　　 目的：研究去细胞猪主动脉瓣膜与生物素、亲和素和抗CD90抗体的结合能力,制备偶联抗CD90抗体的去细胞猪主动脉瓣膜。　　 方法：制备去细胞猪主动脉瓣膜,实验组将生物素与去细胞主动脉瓣膜反应,使瓣膜表面生物素化。阴性对照组:①未与生物素反应的去细胞猪主动脉瓣;②加入能破坏生物素的二硫苏糖醇(DTT),余反应步骤相同。去细胞猪主动脉瓣裁剪成8×8mm2,分6组(n=8),分别加入不同量的生物素(0.5 μ mol,0.75μmol,1.0 μ mol,1.5 μ mol,2.0μ mol和2.5 μ mol)。FITC-亲和素检测,用激光共聚焦半定量技术确定生物素的饱和浓度。抗CD90抗体偶联实验分四组,实验组:应用亲和素与生物素化的去细胞猪主动脉瓣反应,制备表面含亲和素的生物素化去细胞猪主动脉瓣。最后,将生物素化抗CD90抗体连接到修饰后的去细胞猪主动脉瓣。阴性对照组:①生物素化的去细胞猪主动脉瓣,不加亲和素,直接加入生物素化的小鼠抗大鼠CD90,再加入罗丹明标记的抗小鼠的IgG抗体;②生物素化的去细胞猪主动脉瓣,加亲和素,不加生物素化的抗大鼠CD90,再加入罗丹明标记的抗小鼠的IgG抗体;③生物素化的去细胞猪主动脉瓣,加亲和素,再加入生物素化的抗大鼠CD90,不加罗丹明标记的抗小鼠的IgG抗体。去细胞猪主动脉瓣裁剪成8×8mm,分5组(n=8),加入浓度为6mM的生物素250 μl冰上反应2 h,分别加入不同量的亲和素(25 μ g,125 μ g,250 μ g,500 μ g和750 μg),再加入生物素化小鼠抗大鼠CD90抗体,罗丹明标记的二抗检测,用激光共聚焦半定量技术确定亲和素的饱和浓度。抗体偶联去细胞猪主动脉瓣细胞接触毒性试验,Giemsa染色观察与瓣膜接触面细胞增殖情况,扫描电镜观察瓣膜表面细胞生长情况,了解抗CD90抗体偶联猪去细胞主动脉瓣对MSC是否有细胞毒性。　　 结果：瓣膜表面所结合的生物素量(以亲和素的荧光强度表示)逐渐增加。当生物素剂量分别为1.5 μmol,2.0 μmol和2.5 μ mol时,瓣膜表面的生物素渐趋饱和。1.5 μ mol组和2.0 μ mol组,2.0 μ mol组和2.5 μ mol组比较均无显著性差异(F值分别为2.263、3.468和0.017,P值分别为0.155、0.084和0.899),然而1.5 μ mol组和2.5 μ mol组比较有显著性差异(F值为7.861,P值为0.014),故取2.0 μ mol为饱和剂量。随着亲和素剂量的提高,瓣膜表面所结合的亲和量(以二抗的荧光强度表示)逐渐增加。125μ g组和250 μ g组的亲和素所结合的生物素化抗体量有显著性差异(F值为8.416,P值为0.016),250 μ g组和500 μg组,500 μg组和750 μ g组,250 μ g组和750μ g组比较均无显著性差异(F值分别为0.178、0.115和0.017,P值分别为0.682、0.741和0.899),故取250 μg为饱和剂量。CD90抗体偶联猪去细胞主动脉瓣对MSC无细胞毒性,不影响细胞粘附和生长。　　 结论：生物素和亲和素能依次偶联至去细胞猪主动脉瓣,相应浓度生物素和亲和素修饰后的去细胞猪主动脉瓣能在表层偶联抗CD90抗体。抗体偶联的去细胞猪主动脉瓣对MSC的生长,增殖无明显影响。本实验首次提出利用生物素一亲和素系统将抗体偶联至去细胞猪主动脉瓣。为进一步以[生物素-亲和素-生物素化抗体]为中介,促进细胞对去细胞猪主动脉瓣的粘附,奠定了实验基础。　　 二.体外模拟流室系统的制备　　 目的：制备体外模拟流室系统,为进一步研究偶联的抗体在流体环境下的稳定性奠定基础。　　 方法：制备去细胞猪主动脉瓣膜。研制应用于去细胞猪主动脉瓣膜的体外模拟流室系统。搭建体外模拟流室系统,调节泵的流速,观察该系统的工作情况。　　 结果：针对生物瓣膜设计的模拟流室系统使用简便。随着调节泵的流速从100ml/min,150ml/min,200ml/min,至250ml/min,对抗体偶联去细胞猪主动脉瓣表面剪切力可从25.9 dyne/cm2,38.9 dyne/cm2,51.9 dyne/cm2增加到64.8dyne/cm2。　　 结论：我们自行设计的应用于心脏瓣膜的模拟流室系统能准确的对瓣膜表面施加剪切力,且使用简便。　　 三.抗体偶联稳定性的研究　　 目的：在抗体偶联去细胞猪主动脉瓣膜的基础上,进一步研究偶联的抗体在流体环境下的稳定性。　　 方法：制备去细胞猪主动脉瓣膜,利用生物素—亲和素系统将抗CD90抗体偶联至去细胞猪主动脉瓣膜。根据不同的泵转速,实验分四组,从100ml/min,150ml/min,200ml/min,至250ml/min。瓣膜在体外流室系统中持续作用12小时。罗丹明标记IgC抗体结合抗CD90抗体,激光共聚焦显微镜下,应用Leica Q win软件,分析瓣膜表层荧光强度。计算同一个样本在流体冲击前后抗体荧光强度的比值,比较不同剪切力冲击下抗体荧光强度比值的差别。　　 结果：各组间去细胞猪主动脉瓣表面抗CD90抗体的红色荧光强度比值无显著性改变(F值为0.203,P值为0.819)。　　 结论：应用生物素-亲和素系统而偶联于去细胞猪主动脉瓣膜的抗CD90抗体在体外稳定性良好,为增加其对MSC的粘附奠定了基础。　　 第四部分 体外抗CD90抗体偶联去细胞猪主动脉瓣膜对MSC的捕获实验　　 目的：在去细胞猪主动脉瓣偶联抗CD90抗体的基础上,利用模拟层流装置,体外观察瓣膜表面的抗CD90抗体能否捕捉MSC,增加MSC对去细胞猪主动脉瓣膜的覆盖。　　 方法：抗CD90抗体偶联的去细胞猪主动脉瓣膜为实验组,单纯去细胞猪主动脉瓣膜为对照组。将抗CD90抗体偶联的去细胞猪主动脉瓣膜嵌固于模拟流室。取第三代MSC消化、离心制成细胞悬液,调整密度后将约1.4×106的MSC注入流室系统。调节蠕动泵流速,流速调至250 ml/min,转流12 h后,取出瓣膜,扫描电镜观察。使用Leica图像分析系统做细胞数统计,两组之间比较。　　 结果：在1500 μm2的面积内,抗体偶联的去细胞猪主动脉瓣膜组有(25.88±3.18)个粘附。而对照组仅(6.63±1.69)个MSC粘附。抗体偶联的去细胞猪主动脉瓣膜上的细胞数量显著多与对照组(P＜0.05),在嵌固环固定处,未接触含MSC,支架纤维裸露,未见有细胞附着。　　 结论：偶联抗CD90抗体的去细胞猪主动脉瓣膜能够捕捉流体中的MSC,增加MSC对瓣膜的覆盖。该研究的意义在于为偶联抗体的瓣膜支架捕捉血液中的EPC奠定实验基础,为改善TEHV功能,促进自身修复,延长使用寿命,提供了新的理论和方法。