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目的:通过调控膀胱癌(BC)细胞中KLF4的表达,探究KLF4对BC细胞上皮-间质转化(EMT)的影响及KLF4在抑制其EMT过程中的作用机理。方法:1选择两种不同分化程度的BC细胞株并检测其KLF4表达情况1.1 RT-PCR、Western blot检测中分化的5637和低分化的T24两株人BC细胞中KLF4的mRNA及蛋白表达情况。2过表达KLF4基因对BC上皮-间质转化过程的影响及作用的研究2.1 KLF4过表达慢病毒(LV-KLF4)和对照慢病毒(LV-NC)感染5637和T24细胞,建立过表达KLF4的LV-KLF4组细胞和LV-NC组细胞。RT-PCR、WB检测并验证经慢病毒转染的5637和T24两株膀胱癌细胞株中KLF4的mRNA及蛋白变化。2.2 RT-PCR、WB检测5637和T24两株癌细胞过表达KLF4后EMT相关基因的mRNA及蛋白表达量的变化。细胞免疫荧光技术检测5637和T24两株癌细胞中慢病毒转染过表达KLF4后EMT相关基因的蛋白的表达变化。2.3 Transwell实验检测5637和T24细胞中慢病毒转染过表达KLF4后癌细胞侵袭能力的变化。2.4 WB检测慢病毒转染过表达KLF4对5637和T24两株膀胱癌细胞中Wnt信号途径的核心分子β-catenin、c-Myc及MMP9蛋白表达的影响。免疫荧光实验检测经慢病毒转染过的5637和T24两株癌细胞中KLF4过表达后β-catenin蛋白的表达变化。3沉默KLF4基因对BC上皮间质转化过程的影响说明:应用由LV-KLF4慢病毒建立LV-KLF4组细胞作为目的细胞。用含KLF4-siRNA片段转染LV-KLF4组细胞,并命名为siRNA组,KLF4-NC片段转染LV-KLF4组细胞,并命名为NC组。3.1.RT-PCR、WB检测siRNA转染由KLF4基因慢病毒转染建立的LV-KLF4组后,siRNA组与NC组BC细胞KLF4的mRNA及蛋白变化情况,验证转染结果。3.2.RT-PCR、Western blot方法检测siRNA转染由KLF4基因慢病毒转染建立的LV-KLF4组后,siRNA组与NC组BC细胞EMT相关基因的mRNA及蛋白表达变化。细胞免疫荧光技术检测EMT相关基因蛋白的表达变化。结果:1.1实验结果显示5637、T24两种不同分化的BC细胞株中KLF4的mRNA及蛋白表达差异明显,5637中KLF4的表达量显著高于T24(均P<0.05),有统计学意义。2.1通过RT-PCR、WB实验从mRNA及蛋白水平检测发现KLF4在LV-KLF4组的表达水平较LV-NC组明显升高(均P<0.05),差异有统计学意义,证实成功建立过表达KLF4的LV-KLF4组及对照LV-NC组。Transwell实验结果表明LV-KLF4组BC细胞迁移及侵袭能力较LV-NC组显著降低(P<0.05)。2.2 RT-PCR、WB实验结果提示KLF4慢病毒转染5637和T24两株癌细胞后与LV-NC组相比,LV-KLF4组中E-cadherin的表达显著升高,而间质标志物N-cadherin、Vimentin的表达显著降低(均P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示:与LV-NC组相比较,LV-KLF4组中E-cadherin蛋白荧光表达明显增强,且阳性细胞数增多;而N-cadherin蛋白与Vimentin蛋白荧光表达明显减弱,阳性细胞数减少。2.3 WB实验结果提示KLF4慢病毒转染5637和T24两株癌细胞后与LV-NC组相比,LV-KLF4组中细胞内β-catenin总蛋白、胞核内β-catenin蛋白的表达均不同程度降低,同时c-Myc及MMP9蛋白表达也显著降低(均P<0.05)。免疫荧光实验显示:与LV-NC组相比较,LV-KLF4组中β-catenin蛋白荧光表达减弱,阳性细胞数减少,细胞核中的表达也显著减弱。3.1通过RT-PCR、WB实验从mRNA及蛋白水平检测发现siRNA组中KLF4的表达水平显著低于NC组(均P<0.05),差异有统计学意义,证实用siRNA转染由KLF4基因慢病毒转染建立的LV-KLF4组建立沉默表达KLF4的siRNA及NC组构建成功。3.2 RT-PCR、WB实验结果显示经KLF4基因siRNA片段转染沉默表达KLF4后与NC组相比较,在siRNA组中E-cadherin的表达显著降低,而N-cadherin、Vimentin的表达显著升高(均P<0.05)。细胞免疫荧光实验结果显示:与NC组相比较,siRNA组中E-cadherin蛋白荧光表达减弱,且阳性细胞数减少;而N-cadherin蛋白与Vimentin蛋白荧光表达明显增强,阳性细胞数增多。结论:1.KLF4基因过表达抑制BC细胞EMT,KLF4基因沉默表达促进BC细胞EMT。2.KLF4基因诱导BC细胞EMT过程可能受Wnt/β-catenin信号通路调控。