大型真菌入药在我国已有2000多年的历史,它们对人体具有保健、预防和治疗的作用,有降血脂、降血压和提高免疫力等多种的药理活性,特别是它们的广泛抗肿瘤活性最为引入注目。据《中国大型药用真菌图鉴》一书中记载,80%的大型真菌具有良好的抗肿瘤活,通过对真菌多糖的化学结构、生物活性进行深入细致的研究,普遍认为真菌多糖是抗癌的主要成分。真菌多糖具有调节机体免疫、抗突变、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗辐照、抗溃疡等作用,数千种真菌多糖已从真菌中分离纯化,药理作用也得到了深入的研究,并且有一部分已经应用于临床多年,取得了很好的治疗效果。除了多糖,真菌还富含各种优质蛋白质,蛋白质组分占子实体干重的10%-40%。但长期以来,对于真菌蛋白质的研究一直没有得到国内外学者的重视,仅有上百种蛋白或多肽被分离出来,且多集中在对其氨基酸组成、活性分析等初步研究上。近年来,随着蛋白质组学的发展,已有10多种药用真菌蛋白被报道,而且已被证明具有很强的抗肿瘤活性(nM级),这些研究结果提示除多糖外,蛋白质是药用真菌中另一类重要的抗肿瘤活性组分,具有广阔的开发空间和挖掘潜力。香菇(Lentinula edode (Berk) Pegler),是担子菌亚门担子菌纲侧耳科(Pleurotaccae)香菇属真菌,具有极高的营养和药用价值。国内外学者对其进行了大量深入的研究,200多种多糖从香菇中得到分离纯化,并被制成针剂、胶囊等各种药剂广泛应用于临床。香菇C91-3菌株是本课题组经多年筛选得到的一株药用价值极高的菌株(课题组于1991年3月自生物发酵的6株香菇菌丝体中发现其第3株发酵液具有直接抗肿瘤作用,自此开始对其进行深入研究,故命名为“C91-3”,“C”表示‘’China").经过多年大量研究证明其菌丝体发酵液提取蛋白具有良好的抗肿瘤活性[11-13]。本文在前期研究的基础上,对香菇C91-3菌丝体发酵液中的活性蛋白进行分离纯化,并对具有抗肿瘤的活性蛋白进行鉴定和初步的抗肿瘤机理探讨,应用基因工程的方法,构建该蛋白cDNA序列,以期得到基因工程重组的香菇抗肿瘤蛋白成分,为香菇C91-3的深度开发和高效利用提供科学的理论依据,为其临床广泛推广应用奠定一定的基础。目的药用真菌的蛋白、多肽组分已被证明具有广泛的药理活性,从中发现多种具有抗肿瘤、调节免疫的功能蛋白或多肽。真菌蛋白质已成为抗肿瘤新药研究的一个重要方向。本课题组在对香菇C91-3菌株的抗肿瘤活性研究中发现其菌丝体发酵液的混合物在体内、外均具有良好的抗肿瘤活性。本文在此前的研究基础上对香菇C91-3菌丝体发酵液的蛋白质进行分离纯化,对纯化得到的单一蛋白进行体外抗肿瘤活性研究,并对其进行质谱鉴定。根据质谱酶解肽段序列信息与我课题组已建立的香菇C91-3转录组数据库比对,获取相应的Unigene序列,利用基因工程技术获取其基因序列全长,为抗肿瘤蛋白的克隆,重组及表达奠定了一定的基础。方法在前期研究的基础上,改良香菇C91-3菌丝体发酵液配方,发酵液经硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶虑过层析分离纯化得到单一的香菇C91-3菌丝体发酵液蛋白LFP91-3A2,SDS-PAGE确定分子量,并结合基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)分析鉴定蛋白,同时进行肽指纹图谱分析并与网上数据库比对。体外细胞活性实验(MTT法)测定不同浓度的(5ug/ml, 10ug/ml,15ug/ml) LFP91-3A2对小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180和人肺癌细胞A549不同作用时间(24小时,48小时,72小时)的体外抑制肿瘤细胞活性；流式细胞仪对其抗肿瘤机制作进一步探讨,检测不同浓度的(5ug/ml,10ug/ml,15ug/ml) LFP91-3A2对H22肿瘤细胞作用24小时,诱导肿瘤细胞的凋亡率；倒置显微镜和透射电镜观察LFP91-3A2作用的A549细胞形态改变和细胞周期相关性质改变,从凋亡方面对蛋白组分的抗肿瘤机制进行初步探讨。质谱分析蛋白质,并与之前课题组测定的香菇C91-3转录组数据库进行比对,根据比对测序结果,设计引物,提取香菇C91-3总RNA,利用3’-Full RACE、5’-Full RACE方法获得LFP91-3A2基因序列全长,通过生物信息学软件分析LFP91-3A2蛋白理化性质、氨基酸组成及二级结构,并预测其功能结构域。结果通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶虑过层析,从香菇C91-3菌丝体发酵液中分离纯化得到单一的具有抗肿瘤活性蛋白LFP91-3A2。应用MTT法检测其细胞毒效应发现：LFP91-3A2对三种肿瘤细胞都有明显的体外抑制活性作用,其抑瘤率随LFP91-3A2的浓度和作用时间的延长而增加,呈浓度和时间的依赖性关系；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测LFP91-3A2对H22细胞的诱导凋亡作用,结果显示对H22细胞结果显示具有显著的诱导凋亡作用,且呈剂量依赖性,而且流式细胞仪直方图出现亚二倍体峰；透射电镜下可见经LFP91-3A2作用的A549细胞,细胞皱缩、核固缩等典型凋亡细胞形态,亦可见凋亡小体。倒置显微镜下观察经LFP91-3A2作用24h的A549细胞排列疏松,部分细胞脱落,细胞变圆。二者结果均显示LFP91-3A2对A549细胞作用表现出凋亡细胞特征性的改变。根据质谱分析结果与香菇C91-3转录组对比获得对应的Unigene序列,设计上下游引物,提取香菇C91-3总RNA为模板进行3’-Full RACE.5’-Full RACE扩增LFP91-3A2基因,得到一个约1473bp的条带,纯化回收此条带,并克隆至pMD20-T Vector载体并测序,获得LFP91-3A2的cDNA序列,该序列除合成5’和3’末端引物外,还有一条长为621 bp的编码序列。通过分析LFP91-3A2的理化性质、结构及功能基团得知LFP91-3A2具有两个功能域：GIY-YIG结构域和NUMOD结构域。结论香菇C91-3菌丝体发酵液蛋白经分离纯化得到一个具有抗肿瘤活性的单一蛋白LFP91-3A2,分子量约为26kDa。在体外能抑制H22、S180和A549肿瘤细胞活性,其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。质谱分析鉴定LFP91-3A2酶切肽段,并因与香菇C91-3转录组比对,利用分子生物学技术扩增获得其基因序列,为香菇抗肿瘤蛋白LFP91-3A2的克隆,基因重组和体外表达奠定基础。