1.以氨肽酶N为靶点　　 氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN),也被称为CD13,是一种Ⅱ型锌离子依赖性金属蛋白酶,它隶属于M1氨肽酶家族。氨肽酶N广泛存在于小肠、肾及中枢神经系统的多种细胞表面。与正常细胞相比,该酶在肿瘤细胞表面高水平表达。研究发现,APN在肿瘤生长、侵袭和转移过程中发挥着重要作用。例如,APN可降解细胞外基质,促进原发肿瘤的生长侵袭,有利于肿瘤的转移；同时APN还可以促进肿瘤新生血管的形成,是肿瘤新生血管的调节器；另外该酶还能够降解胸腺肽和白介素,从而降低机体免疫机能。　　 正因为APN与肿瘤的密切关系,APN抑制剂的研究已经成为抗肿瘤研究领域的一个热点。Bestatin作为第一个上市的APN抑制剂,临床上主要是作为其他抗癌药物的辅助药物,也可以用于治疗急性成人非淋巴性白血病。近年又发现许多天然APN抑制剂,如Probestatin,Amastatin,Curcumin等；另外,人们还合成了许多小分子化合物APN抑制剂,如α-氨基磷酸抑制剂,β-氨基硫醇类抑制剂等。本课题组以APN为靶点,经十几年的研究亦报道了许多小分子类肽化合物。　　 同时,在利用噬菌体对多肽的筛选过程中发现了含有NGR三肽的结构,能靶向性的与APN选择性结合,这一发现可以利用于药物的靶向运输,从而可以使抗癌药物在肿瘤中富集并大大降低抗癌药物的毒副作用。如大量文献中多次报道将hTNF与NGR结合得到的靶向药物在大大提高hTNF的抑瘤活性的同时,也降低了其严重的神经毒副作用。　　 本研究主要分为两个部分:　　 第一:以APN为靶点,在充分调研文献的基础上,通过计算机辅助药物设计技术,设计、合成一系列以Bestatin为骨架的小分子化合物,并对它们进行初步的活性筛选,以期待发现具有较好APN抑制活性的新型化合物。　　 方法:　　 由APN的晶体结构及抑制剂与酶的作用模式可以看出与APN活性位点相对应,对应的APN抑制剂应由四个部分组成:A疏水性芳环侧链；B锌离子螯合基团位于中间连接片段上；C疏水性芳环侧链；D疏水性芳环侧链。A疏水侧链和C、D两个疏水侧链经B部分相连。Bestatin的结构中的苯环和异丙基分别起到A和C的作用,羟基和羰基是起到B的作用；我们在此结构的基础上又延伸出新的侧链D,从而得到一系列的Bestatin衍生物来增强抑酶活性。　　 本研究将目标化合物进行了体外抑酶实验,部分化合物进行了体外肿瘤细胞(ES-2)生长抑制以及体内抗肿瘤转移实验,从中筛选出具有APN良好抑制活性的抗癌先导化合物。　　 结果:　　 本系列共有6个目标化合物,并对所有化合物通过核磁共振氢谱、电喷雾质谱等方法进行了结构确证。经查阅文献证实,所合成的目标化合物为新型化合物,未见文献报道。　　 在这6个化合物中,LYP3、LYP4、LYP5、LYP6的抑酶活性略优于阳性对照药Bestatin。　　 MTT法体外细胞实验测定了目标化合物对ES-2卵巢透明癌细胞株生长抑制作用,结果显示LYP3、LYP4、LYP5、LYP6对癌细胞的抑制作用优于Bestatin。　　 由于LYP2良好的稳定性和高水溶性,我们还将LYP2做了体内抗肿瘤细胞转移实验,同样表现出了良好的抑制率。　　 最后,我们还得到一个化合物LYP1与突变嗜酸热源菌三角交互作用因子F3的共结晶复合物。　　 结论:　　 本研究基于APN的晶体结构及抑制剂与酶的作用模式,利用计算机软件进行设计、合成的Bestatin衍生物具有良好的APN抑制活性。所设计的合成路线科学合理,原料经济易得。通过初步的活性测试发现了具有进一步研究价值的抗癌先导化合物。　　 第二:由于天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸组成的三肽是APN的选择性配体,能够与肿瘤细胞表面大量表达的氨肽酶N进行选择性结合。我们对该三肽结构进行了改变,设计合成了天冬酰胺-甘氨酸-硝基精氨酸三肽,并将其作为靶向载体,通过共价键与传统抗实体瘤药物五氟尿嘧啶相连,测试所得到的化合物的体内抗肿瘤活性。　　 2.以热休克蛋白90为靶点　　 热休克蛋白90(Hsp90)是一种分子量为90kDa的分子伴侣。它的生理学功能是对其蛋白质底物进行正确的折叠、维持蛋白质的正常功能表达。近几年的研究表明,Hsp90与多种疾病的发生都有着密切的关系,如:癌症、神经性病变等。目前,由于Hsp90在肿瘤的发生、生长和存活发面发挥重要的作用,已经成为治疗癌症的热门靶点。　　 在与肿瘤的发生与发展有关的多种蛋白中,许多都是Hsp90的底物。这些底物蛋白来自于多种信号传递系统。譬如:突变型p53、细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(MEK1,MEK2)、Raf、Akt、Bcr-Ab1和ErbB2等等。特别是ErbB2,在多种肿瘤中都有过度的表达。　　 Hsp90能够维持和维护上述这些蛋白的结构和功能。通过对Hsp90活性的抑制,能够达到降解这些蛋白底物的作用,从而抑制肿瘤的发生与发展。　　 Hsp90其结构是一种同源二聚体,由N末端,中间片段和C末端组成。在这个结构中,主要有3个分子结合位点,其中研究较为透彻的是位于N末端的ATP酶活性位点,此处也是传统Hsp90抑制剂的结合位点。由于APT酶活性位点对Hsp90功能的维持起着重要的作用,所以,通过对此位点的抑制,能够起到抑制Hsp90活性的作用。　　 Geldanamycin是一种Hsp90天然抑制剂,但是由于其水溶解度底、代谢稳定性差、毒性高,限制了其作为Hsp90抑制剂的应用。我们的工作就是在geldanamycin的结构基础上,通过对其17位甲氧基的取代,而得到了一小系列化合物,期待能够得到活性、稳定性以及水溶性均优于geldanamycin的Hsp90抑制剂。　　 方法与结果:　　 位于geldanamycin17位的甲氧基是非抗Hsp90活性基团,并且它极易被一些脂肪或者芳香胺基所亲核取代。在此基础上,我们用不同的具有伯胺基的小分子弱碱性化合物取代17位甲氧基,从而得到了一小系列,总共7个化合物。此系列化合物的结构都得到了氢谱的确证。　　 3以caspase为靶点的近红外荧光标记物的设计与合成　　 红外荧光发色团所发出的近红外光由于能够极少量的被生物体内的血红蛋白、水、脂类等物质吸收,已经成为监控生物靶标的新兴技术。　　 而在生物体内,存在一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,即caspase,它是由14种不同的酶组成的一个酶家族。他们能够在凋亡信号的激发下,发生级联性的激活,并最终导致细胞的凋亡,因此它们在细胞凋亡的过程中发挥重要的作用。　　 含有氟甲基酮(FMK)结构的化合物已经被发现能够作为caspase不可逆的抑制剂来应用,在本实验中,我们设计合成了一种靶向与caspase的近红外发色团,它的结构中包含了一种常用的近红外发色团IR780以及caspase抑制剂FMK。我们用其对处于凋亡状态下的肿瘤细胞进行监测。　　 方法与结果:　　 我们首先设计合成了一种含有fmk结构的caspase抑制剂,通过一个长链将其与IR780相连,从而得到了一个结构全新的、靶向于caspase的近红外发色团,并对其进行体外凋亡肿瘤细胞显色实验,实验结果表明此发光团能够对处于凋亡状态的肿瘤细胞进行非浓度依赖性的显色。