胃癌是目前全世界最常见肿瘤之一,进展期胃癌的五年生存率低,竟然达到了 30%。导致进展期胃癌预后差的主要原因是肿瘤细胞具有极高的侵袭和转移能力,肿瘤细胞容易向周围组织及淋巴结侵袭,最终转移至其他器官,这是一个复杂的多步生理过程。上皮细胞-间质细胞转化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)在胃癌的侵袭和转移过程中起着重要的作用,是胃癌多步骤转移的早期事件。目前研究发现很多信号通路通过协同、拮抗相互交叉参与调节EMT的发生过程,如Ras-MAPK、Wnt、Rho、Src、PI3K/AKT及Hedgehog通路等。半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)是一种分布在多种哺乳动物体内的多种器官组织中的凝集素,以单聚体或者非共价结合的同型二聚体形式分别分布在细胞内和细胞外,与肿瘤增殖、侵袭转移和复发等过程关系密切。课题组前期研究发现胃癌高表达Gal-1可以促进肿瘤血管生成并且胃癌组织高表达Gal-1提示预后差。然而,Gal-1蛋白在胃癌中的具体机制不明。Hedgehog(Hh)信号通路在肿瘤细胞的增殖、周期、分化、侵袭和转移过程中发挥十分重要作用。Hh通路主要由Hh配体,膜受体Ptch、跨膜信号转导蛋白Smo和锌指转录因子 Gli-1(Glioma-associated oncogenetranscription factors-1)组成。Gli-1 是级联传导的末点,被公认为Hh信号通路活化的关键因子,在基因信号转导过程中起着不可估量的作用。有研究发现:胰腺癌中Gal-1表达通过直接影响Hh/Gli-1通路促进胰腺癌发生发展。然而,在胃腺癌中Gal-1是否通过Hh通路引起胃腺癌的侵袭与转移的机制的研究甚少。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是一种从中草药——青蒿中提取的倍半萜内酯类物质衍生物,也是青蒿治疗疟疾的主要活性成分。DHA抗疟作用明显,是目前用于治疗耐药疟疾、恶性疟疾和脑型疟疾的最有效的药物之一。近年的大量研究结果表明,DHA可抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,主要表现为该单体能诱导肿瘤细胞的凋亡、细胞周期停滞、抗肿瘤血管生成和抑制EMT过程而实现的。尽管这一作用已经在多种肿瘤中被研究证实,但是DHA对于胃腺癌的作用及相关机制仍然未被阐明,Gal-1与DHA的抗肿瘤作用之间是否存在相互关系鲜有报道。本研究主要在前期研究的基础,旨在探讨Gal-1与EMT标志物在胃腺癌组织中表达及之间的相互关系,构建Gal-1过表达/干扰的慢病毒载体感染胃腺癌细胞株,研究Gal-1促进EMT发生的分子机制,观察DHA对胃腺癌细胞增殖、侵袭及Gal-l蛋白表达、活性的影响,初步探讨DHA治疗胃腺癌的相关机制。本课题共分为三个部分研究内容。第一部分Galectin-1和EMT标志物在胃腺癌组织中的表达、相关性及临床意义和Galectin-1在胃腺癌细胞系中的表达研究目的:本部分研讨Gal-1与EMT相关标志物细胞粘附分子上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)在胃腺癌组织中的表达及之间的关系,以及它们与肿瘤临床特征和预后之间的关系;筛选出高低表达的胃腺癌细胞作为后续细胞分子生物学实验的研究对象。方法:收集江苏省苏北人民医院手术切除的胃腺癌组织和癌旁正常胃黏膜组织标本:采用免疫组化方法检测162例胃腺癌患者的癌组织和正常组织中Gal-1蛋白、E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的分布及表达水平。单因素分析比较Gal-1与E-cadherin、Gal-l与Vimentin蛋白的表达差异及互相之间的关系。按照胃腺癌患者的年龄、性别、原发性肿瘤的大小、组织学类型、临床分期、有无淋巴结的转移将病例分组,应用卡方检验分析研究蛋白的表达与肿瘤临床病理特征之间的关系。非线性相关分析两种蛋白的关系。采用Western blot和实时荧光定量-PCR法检测人胃腺癌AGS细胞、人胃腺癌MKN-45细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞、人胃腺癌MKN-74细胞和人胃腺癌MGC-803细胞中Gal-1的蛋白和mRNA表达水平。结果:Gal-1和Vimentin在胃腺癌组织中高表达,E-cadherin在胃腺癌组织中低表达。Gal-1在癌旁正常胃黏膜组织中低表达,E-cadherin在癌旁正常胃黏膜组织中高表达,vimentin在癌旁正常胃黏膜组织中低表达。Gal-1的表达水平与胃腺癌的分化程度、浸润深度、TNM分期以及有无淋巴结转移有关;E-cadherin的表达水平与胃腺癌的分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移有关;Vimentin的表达强弱与胃腺癌的浸润深度、TNM分期和淋巴结转移有关。胃腺癌组织中Gal-1与E-cadherin的表达呈负相关;Gal-1与vimentin的表达呈正相关。在人胃腺癌AGS细胞、人胃腺癌MKN-45细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞、人胃腺癌MKN-74细胞和人胃腺癌MGC-803细胞中的表达,MGC-803细胞Gal-1的蛋白和mRNA水平表达最高,MKN-74中表达水平最低。结论:Gal-1蛋白和EMT标志物蛋白在胃腺癌组织中与胃腺癌的侵袭转移密切相关;侵袭性强的胃腺癌细胞MGC-803细胞Gal-1呈高表达,侵袭性弱的胃腺癌细胞MKN-74细胞Gal-1呈低表达。第二部分Galectin-1通过Hedgehog通路调控胃腺癌细胞上皮间质转化的作用研究目的:观察Gal-1表达水平对胃腺癌细胞发生EMT的影响:并探讨Gal-1诱导胃腺癌细胞发生EMT的可能机制。方法:构建包装Gal-lshRNA和Gal-1过表达慢病毒载体,感染胃腺癌细胞,筛选获得稳定转染株,Western blot检测Gal-1表达水平;观察Gal-1表达水平后细胞的形态,采用Matrigel invasion实验检测透过聚碳酯膜上小孔的胃腺癌细胞数评价细胞的侵袭能力。应用Western blot和实时荧光定量PCR方法检测细胞中上皮性标志物E-cadherin和间质性标志物vimentin蛋白和mRNA水平;采用Western blot和实时荧光定量PCR方法检测Gal-1表达水平改变后Gli-1表达水平;利用β-lactose(Gal-l化学性竞争抑制剂)证实内源性Gal-1通过诱导Gli-1表达增强引起EMT的发生。结果:成功构建包装了慢病毒载体:LV-Gall-shRNAl,LV-Gall-shRNA2,LV-Gall-shRNA3,LV-Gal-1;相应的对照载体:LV-shRNA-Control,LV-Control。通过观察绿色荧光表达结合抗生素筛选获取稳定感染的细胞系。利用Westernblot证实感染LV-shRNA-Control的MGC-803细胞,Gal-1的表达明显下降(P<0.05);感染LV-Gal-1可明显增加Gal-1在MKN-74细胞中的表达(P<0.05)。Matrigel invasion实验数据显示,与感染LV-shRNA-Control的MGC-803细胞相比,LV-Gall-shRNA3感染可显著降低MGC-803的侵袭细胞数(P<0.05),LV-Gal-1感染可明显增加MKN-74细胞中的侵袭细胞数(P<0.05)。Western blot和实时荧光定量PCR实验表明LV-Gal-1感染的MKN-74细胞的E-cadherin的表达明显减少和Vimentin的表达明显增加(P<0.05);慢病毒shRNA3感染的MGC-803细胞中E-cadherin蛋白和Mrna表达量明显增强,相反Vimentin的表达明显减少(P<0.05)。我们使用Western blot和实时荧光定量PCR实验检测Hh信号通路上的活化关键因子Gli-1,实验数据结果发现干扰Gal-1的表达可以明显抑制Gli-1表达,高表达Gal-1可以增强Gli-1表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。为了明确内源性Gal-1对于胃腺癌细胞EMT的影响,我们使用β-lactose抑制外源性Gal-1的作用,结果发现用β-lactose处理组和空白对照组相比Gli-1、Vimentin蛋白表达显著增强并且抑制了 E-cadherin蛋白和mRNA的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Gal-1通过激活Hh/Gli-1信号通路诱导胃腺癌细胞EMT的发生。第三部分双氢青蒿素对Galectin-1诱导的人胃腺癌细胞上皮间质转化影响目的:本研究初步评估双氢青蒿素(DHA)对胃腺癌细胞株抑制及凋亡、Gal-l表达调控的影响,探讨DHA抗肿瘤作用的可能机制。方法:体外培养胃腺癌MGC-803细胞株,利用DMSO将DHA释成7个浓度梯度:1、2、4、8、16、32、64μM 分别处理细胞 12h、24h、48h,并设立顺铂(cis-diaminedichloroplatinum,DDP)最终浓度10μg/mL用作阳性对照组,应用细胞MTT方法检测不同浓度的DHA对高表达的Gal-1胃腺癌MGC-803细胞增殖抑制情况,并用SPSS软件计算DHA作用于MGC-803细胞的50%抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50);采用细胞划痕实验检测对比DHA对人胃腺癌MGC-803细胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803细胞迁移能力;采用Matrigel invasion实验对比DHA对人胃腺癌MGC-803细胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803细胞侵袭能力;采用Western blotting及qPCR检测对比DHA对人胃腺癌MGC-803细胞和感染LV-Gall-shRNA的MGC-803细胞中Gal-1、Gli-1和上皮转化相关标志因子E-cadherin和Vimentin蛋白和mRNA表达的影响。结果:MTT结果显示DHA作用于人胃腺癌MGC-803细胞12h、24h、48h后的IC50值分别是 26.03μM、11.13μM、6.784μM,阳性对照组 DDP(10μg/mL)在 12h、24h、48h 时抑制细胞的活力分分别为55.29%,26.55%和19.78%。DDP(10μg/mL)的抑制细胞活力的效果等同于26μM的DHA。DHA对高表达的Gal-1胃腺癌细胞MGC-803细胞的增殖具有明显的抑制作用;细胞划痕实验结果显示DHA能够明显减缓Gal-1引起的MGC-803细胞的迁移能力;Matrigelinvasion实验结果显示DHA能够明显减缓Gal-1引起的MGC-803细胞的侵袭能力;Western blot及实时荧光定量PCR数据显示DHA可显著抑制人胃腺癌MGC-803细胞中Gal-1的表达,并抑制Gal-1诱导的胃腺癌细胞EMT的发生,即E-cadherin表达的下调和Vimentin表达的上调。结论:DHA能够显著抑制胃腺癌细胞的迁移,其机制可能与DHA抑制胃腺癌细胞中的Gal-1的表达有关。