人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human Immunodeficiency Virus Type I，HIV-1）感染可以导致获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），即艾滋病。艾滋病已成为有史以来最具破坏性的传染病之一：目前全球共存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）约3340万人（约占总人口的0.6％），在中国这个数字也有是74万，且2009年当年中国新发艾滋病病毒感染者就有4.8万人。HIV-1一旦感染，便很难被机体清除；结合历史上多次传染病控制经验，研发有效安全的疫苗将是控制HIV-1大规模流行的最佳途径。流行病学调查显示我国HIV-1最主要的流行亚型或流行重组型是CRF07 BC，CRF08 BC，B’（泰国B）和CRf01_AE。其中AE重组型病毒主要通过性接触途径传播，而性接触是已成为我国新发感染的主要途径，伴随这一情况，AE重组型在新发感染中的比例也呈逐年上升的态势。因此研发针对HIV-1 AE重组型的预防性疫苗，对于控制我国HIV-1的传播有重要意义。　　 包膜蛋白是设计HV-1抗体疫苗时选择的主要免疫原。但是，天然的HIV-1包膜蛋白由于高度糖基化导致一些保守抗原表位遮蔽，因而天然HIV-1膜蛋白难于有效地活化广谱中和抗体。有研究显示，通过对包膜蛋白糖基化位点的修饰改造可以消除这些不利因素，提高HIV-1膜蛋白活化中和抗体的能力。所以在本研究的第一部分，我们构建了表达HIV-1 AE重组型膜蛋白gp140的DNA疫苗，并在此基础上通过定点突变方法分别突变了gp140 V1/V3的157/161和V4区的382/388糖基化位点，并构建成相应DNA疫苗m157/161和m157/161。Western Blot结果显示，改造前后的质粒均可以高效表达目的蛋白，其中包括大量以分泌形式存在的蛋白；改造对蛋白的表达量无明显影响。　　 为了评价上述几种DNA疫苗活化的免疫反应特征，我们用所构建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠4次，最后一次免疫两周后处死小鼠进行检测。基于IFN-γ检测的ELISPOT实验显示，gp140免疫组小鼠的特异性T细胞反应为（2432±586）SFCs/106脾细胞，m157/161组为（2682±893）SFCs/106脾细胞，m382/388组为（2360±560）SFCs/106脾细胞，各实验组间无统计学差异。说明疫苗可以活化高水平T细胞反应，且糖基化改造对疫苗活化的特异性T细胞反应强度没有显著影响。EIASA实验检测小鼠血清中的结合抗体，结果显示，gp140组平均抗体滴度是4800，m157/161组是1600，m382/388组是1200。两个糖基化改造组显著低于未改造组，p<0.02。说明糖基化位点突变后，膜蛋白疫苗活化结合抗体反应的能力明显下降。　　 最后，用体外中和实验评价小鼠血清对3株B/C重组型HIV-1临床分离株（XBC6371，XBC0793和XBC6431）的中和能力。数据显示：对XBC6371和XBC6431病毒株，gp140免疫组的血清几乎没有中和作用，m157/161和m382/388组有个别小鼠出现6％～16％的中和活性；中和XBC0793病毒时，m157/161组平均病毒抑制率为47％，显著高于gp140免疫组（17.7％），p=0.023；m382/388平均病毒抑制率为49％，也显著高于gp140免疫组，p=0.013。说明157/161和382/388位点的糖基化改造可以提高HIV-1AE亚型gp140疫苗中和异源型别病毒能力，并且中和活性的提高并不是因为结合抗体的活化导致的。这部分实验结果说明，本实验构建了可以有效活化结合抗体和T细胞反应的AE亚型膜蛋白疫苗；本实验开发的糖基化位点改造方案为增强HIV膜蛋白疫苗活化中和抗体能力提供了一定思路。后续应选择更多不同来源病毒株对其中和能力进行进一步验证，其中和能力提高的原因也需要进行进一步研究。　　 另一方面，合适的载体是提高疫苗效果的有效途径之一。经过多年临床使用的、安全性好的复制型痘苗病毒载体疫苗将是艾滋病载体疫苗未来发展的主流方向之一。相对于DNA疫苗或痘病毒疫苗单独免疫，DNA初免.痘病毒加强策略可以提高免疫原的免疫原性，并且避免了加强针对载体的免疫反应。因而本研究第二部分中，我们构建了表达HIV-1 AE亚型包膜蛋白的复制型天坛株痘苗病毒载体疫苗，并使用DNA疫苗初免/痘苗病毒加强策略，在小鼠模型评价疫苗的免疫效果。以往研究发现，包膜蛋白去除胞内区和跨膜区的截短型gp140作为可分泌抗原，可以活化高水平的抗体反应；而保留跨膜区，仅去除胞内区的另一种截短型包膜蛋白gp145被证明相对gp140可以更好的活化T细胞反应。我们设想，在DNA初免/痘苗病毒加强策略下，用gp140和gp145先后免疫同一个体是否可以同时活化高水平的T细胞反应和抗体反应?于是在第二部分研究中，我们设计了gp140和gp145疫苗异源交叉初免/加强的实验方案，即用一种截短型膜蛋白DNA免疫3次后，用另一种截短型膜蛋白重组痘苗病毒加强免疫1次，以探讨不同免疫方案活化的免疫效果，并选择最优方案。　　 我们首先用ELISA实验方法检测了疫苗活化的结合抗体，结果显示gp140DNA-gp140痘苗免疫组和gp140DNA-gp145痘苗免疫组活化了很高的抗体反应，滴度的几何平均值分别为12800和19401；而gp145 DNA-gp145痘苗免疫组和gp145DNA-gp140痘苗免疫组活化的结合抗体滴度的几何平均值分别只有566和606。本结果证实了gp140初免活化抗体的能力高于gp145初免；同时发现在本免疫策略下，初免选择的DNA免疫原类型主要决定了小鼠最终的抗体滴度。接着我们用基于IFN-γ检测的ELISPOT实验方法评价了各实验组活化的特异性T细胞反应水平。结果显示，gp145疫苗初免加强组活化的T细胞反应（（3424±650）SFCs/106脾细胞），高于gp140疫苗初免/加强组（（1918±442）SFCs/106脾细胞）。并且，gp140 DNA初免的小鼠，用gp145痘苗异源加强可以活化比用gp140加强更高一些的T细胞反应；同样，用gp145 DNA初免的小鼠，用gp145加强也比用gp140加强活化的T细胞反应略高。这部分数据说明，相对于gp140，gp145无论用做初免还是加强，都可以更好的活化T细胞反应。结合以上两部分数据可以看出，gp140 DNA初免/gp145痘苗病毒加强是可以同时活化高水平的T细胞反应和结合抗体反应的免疫方案。　　 为了深入了解该疫苗活化的T细胞反应特征，本部分进一步研究了AE亚型膜蛋白疫苗在BALB/c（H-2d）小鼠模型上的T细胞表位分布，用肽库作图筛选法，我们定位到几个可以活化相对较强T细胞反应的肽表位：35号肽（NSNNTTNGPNKIGNI）、16号肽（ETEVHNVWATHACVP）、136号肽（QQQSNLLRAIEAQQH）和106号肽（GQAMYAPPISGRINC）。其中，第35号肽是一个很强的T细胞免疫优势表位，针对这个表位的T细胞反应强度占到总T细胞反应的61.3％。针对以上几个肽表位的T细胞反应占总T细胞反应的81.7％，说明本疫苗在BALB/c小鼠体内活化的T细胞免疫反应主要集中于几个优势表位上。经过与Los Alamos HIV数据库和其他研究文章的比对，我们发现本实验定位到的35号肽表位为本实验首次发现到的H-2d限制性T细胞表位。该研究将为评价HIV疫苗在H-2d型遗传背景下的免疫效果提供数据支持。本研究也存在一定的局限之处，期待对本研究的疫苗和免疫策略在非人灵长类大动物模型的进一步评价及对其活化中和抗体能力的进一步评价；也提示了开发可以活化针对更多表位，尤其是保守表位的T细胞反应免疫策略的重要性。