研究背景创伤修复是一个复杂的生物学过程,涉及多种细胞、因子和细胞外基质的协调有序的参与。皮肤是全身最大的器官也是最容易受到损伤的器官,其在抵御外来各种伤害、调节体温、维持体内外液体平衡方面均发挥着重要的作用,因此研究皮肤的创面愈合对于维持机体正常生理功能有重要的意义。影响创面修复的因素众多,其中修复细胞起着主导作用,创伤后修复细胞在创面微环境的作用下发生增殖、迁移、分化、分泌、凋亡等生物学行为,任何影响修复细胞生物学过程的因素都能直接改变创面修复的结局。创面微环境是影响修复细胞生物学行为的重要因素,其主要由创面组织所处的外部环境和创面组织细胞直接接触的内部环境组成,创面微环境对修复细胞的生物学行为的影响是创面修复的核心问题之一。成纤维细胞是皮肤组织中主要细胞类型,既往的研究表明成纤维细胞在创面修复中发挥着重要的作用:创伤后在各种因素刺激下发生增殖和迁移,同时分泌大量的细胞外基质填补创面,其还能分化为肌成纤维细胞收缩创面进一步加快创面缺损的修复。近来的研究表明成纤维细胞的异质性很高,不同的细胞亚群在创面修复中发挥着不同的功能,比如真皮下层的成纤维细胞主要参与创面缺损的早期填充如形成肉芽组织,而上层的成纤维细胞则主要负责后期毛囊的重建。更值得关注的是成纤维细胞还具有极强的可塑性,目前成纤维细胞是诱导多能干细胞和直接的谱系间重编程时应用最广,且成功率最高的种子细胞。成纤维细胞已被成功诱导为多种类型的细胞包括多能干细胞、心肌细胞、神经元、神经祖细胞、胰岛细胞、造血干细胞等。但目前对于机械创伤后皮肤成纤维细胞可塑性尤其是干性和辐射反应性变化尚不完全明确,有待深入系统研究。研究方法1.体外机械创伤对皮肤成纤维细胞生物学特性影响应用了体外划痕模型模拟创伤,划痕后观察不同时间点创缘成纤维细胞的细胞形态学改变,用Ki67检测创伤后成纤维细胞被激活的时间,用干细胞相关标志物检测创伤后成纤维细胞干细胞相关特性变化,用集落形成实验检测创伤后成纤维细胞自我更新能力的变化,用转录组测序结合生物信息学分析方法检测创伤后成纤维细胞转录水平的变化。2.创面微环境对皮肤成纤维细胞干细胞相关特性的影响首先建立了小鼠单存创伤模型,并分离出肉芽组织细胞,用cck-8、集落形成实验、成脂、成骨诱导分化实验检测了肉芽组织细胞的生物学特性,将肉芽组织细胞局部移植到放射复合伤的小鼠创面,检测其对创面愈合速度和质量的影响,在前期实验基础上,结合mir-21拮抗剂检测mir-21对肉芽组织细胞的生物学特性的影响,进一步结合ros清除剂证明mir-21调节肉芽组织生物学特性是否通过调节ros起作用。分离出野生型新生鼠真皮细胞和mir-21敲入新生鼠真皮细胞并结合mir-21拮抗剂和ros清除剂再次在新生鼠真皮细胞中证明mir-21/ros通路调控成纤维细胞的生物学特性。3.机械创伤对皮肤成纤维细胞辐射反应性的影响建立体内和体外放射复合伤模型,通过检测细胞的集落形成能力和细胞核γh2ax的表达,评估创伤和放射的时间顺序对皮肤成纤维细胞损伤的影响;用彗星实验、pi/annexinv凋亡检测、细胞周期检测、微核检测评估了创伤对皮肤成纤维细胞辐射反应的影响;通过检测dna损伤修复相关蛋白表达评估创伤对皮肤成纤维细胞的辐射损伤修复的影响;用westernblot检测pi3k/akt通路在划痕损伤后皮肤成纤维细胞中的变化,并应用pi3k和gsk-3β抑制剂验证结果;用westernblot和免疫荧光染色检测创伤后成纤维细胞β-catenin的表达变化,用β-catenin的sirna抑制其表达后检测了β-catenin对皮肤成纤维细胞干性的调节以及对辐射抵抗的作用;通过检测创伤后成纤维细胞的ros水平、抗氧化蛋白的表达反应创伤对成纤维细胞抗氧化能力的影响;用westernblot和免疫荧光染色检测创伤后成纤维细胞nrf2的表达变化;用nrf2的sirna抑制其表达后检测了nrf2对皮肤成纤维细胞抗氧化能力和dna损伤修复能力的调节以及对辐射抵抗的作用。研究结果1.机械创伤对皮肤成纤维细胞生物学特性的影响1.1成功建立体外划痕损伤模型,应用此模型发现创伤后皮肤成纤维细胞能被诱导为小圆细胞表型;约创伤后36h创缘成纤维细胞被激活,且其激活与创伤程度无关;创伤后创缘成纤维细胞的干细胞标志物sox2和vimentin表达明显增高,而其它检测的标志物未见明显变化,集落形成能力也明显增强。1.2创伤后成纤维细胞的转录组表达明显变化:局部粘附信号通路,tgf-β信号通路和pi3k/akt信号通路、多能干细胞相关信号通路等均发现明显的变化,局部粘附相关的分子、细胞周期相关分子、细胞迁移相关分子和dna损伤修复相关分子表达均明显上调。2.创面微环境对皮肤成纤维细胞干细胞相关特性的影响2.1成功分离出创伤后的皮肤成纤维细胞(肉芽组织细胞),发现其具有较正常细胞更强的增殖、集落形成和成脂、成骨分化能力。移植肉芽组织细胞到放射复合伤小鼠创面能促进创面愈合速度,减少愈合后创面瘢痕中胶原沉积。2.2发现mir-21在肉芽组织细胞中高表达,应用mir-21拮抗剂antagomir能明显促进肉芽组织细胞的增殖和集落形成能力,却抑制其迁移和成脂、成骨诱导分化能力,提示mir-21能负向调控肉芽组织细胞的干性却促进其迁移和分化。2.3发现mir-21能调控肉芽组织细胞中ros表达,应用ros清除剂nac能明显促进肉芽组织细胞的增殖和集落形成能力却抑制其迁移和成脂、成骨诱导分化能力,提示mir-21对肉芽组织细胞生物学特性影响是通过调控内源性ros发挥作用的。2.4应用野生型新生鼠真皮细胞和mir-21新生鼠真皮细胞进一步验证了mir-21通过调控内源性ros而抑制皮肤成纤维细胞的增殖和集落形成能力而促进其迁移和成脂、成骨诱导分化能力。3.机械创伤对皮肤成纤维细胞辐射抵抗的影响3.1成功建立体外放射复合创伤模型并发现先创伤后照射较单纯照射和先照射后创伤的皮肤成纤维细胞存活更多,而先照射后创伤较单纯照射的成纤维细胞存活更少,进一步研究不同剂量照射后,先创伤后照射均较单纯照射的成纤维细胞存活更多,提示创伤能增强皮肤成纤维细胞的辐射抵抗。但先创伤后照射的肿瘤细胞却较单纯照射的肿瘤细胞存活更少,提示创伤能增强肿瘤细胞的辐射敏感性。3.2先创伤后照射较单纯照射成纤维细胞在照射后不同时间内的γh2ax表达明显减少,但在肿瘤细胞中结果却相反;彗星实验中先创伤后照射的成纤维细胞形成尾矩和拖尾中dna的含量均较单纯照射的成纤维细胞少;先创伤后照射的成纤维细胞在照射后形成的微核数和凋亡细胞比例均较单纯照射成纤维细胞明显减少;3.3创伤后的成纤维细胞和未创伤的成纤维细胞在照射后均会发生明显的细胞周期阻滞,前者主要阻滞在g2/m期,后者主要阻滞在g1/s期,而前者从g2/m期阻滞中恢复的时间较后者从g1/s期阻滞中恢复更快;照射后检测dna损伤修复蛋白表达发现,先创伤后照射成纤维细胞的同源重组修复蛋白rad51较单纯照射的成纤维细胞明显增高,而非同源重组蛋白表达未见明显差异。而肿瘤细胞中修复相关蛋白未见明显差异。3.4体内实验发现,先创伤后照射组的皮肤成纤维细胞在照射后γh2ax的表达较单纯照射后皮肤成纤维细胞消失更快;先创伤后照射小鼠肉芽组织细胞较先照射后创伤小鼠肉芽组织细胞具有更强的集落形成能力。3.5创伤后成纤维细胞2h内激活态AKT表达明显增高,同时其下游的P-S9 GSK-3β表达也明显增高,GSK-3β被抑制后,首次发现其下游的Nrf2和β-catenin的表达同时增高,应用PI3K抑制剂能够明显逆转创伤引起的Nrf2和β-catenin的增高,应用GSK-3β抑制剂能模拟创伤因素上调未创伤成纤维细胞中Nrf2和β-catenin表达,提示创伤激活了PI3K/AKT通路上调转录因子Nrf2和β-catenin.3.6创伤后β-catenin明显上调,结合应用其siRNA证明其能调控Sox2表达而增强皮肤成纤维细胞的干性,进而增强皮肤成纤维细胞的辐射抵抗。3.7创伤通过PI3K/AKT通路增强Nrf2表达,结合其siRNA证明:它一方面能上调SOD1表达而提高成纤维细胞的抗氧化能力,另一方面可部分调控RAD51的表达提高成纤维细胞的DNA损伤修复能力,进而增强皮肤成纤维细胞的辐射抵抗。研究结论1.体内外实验证明机械创伤能激活皮肤成纤维细胞发生增殖,其诱导增殖的时间窗为36h左右,且其诱导增殖与创伤严重程度无关;体外从细胞表型、转录组表达水平、干细胞特异的标志物等多方面首次证明机械创伤能增强皮肤成纤维细胞的干性。2.在体进一步证明机械创伤能明显增强皮肤成纤维细胞的增殖、自我更新和多向分化潜能等干细胞相关生物学特性;并在此基础上筛选并证明miR-21能通过调节内源性的ROS表达而负向调控成纤维细胞的增殖、自我更新等干性相关特性,但促进其迁移和分化。3.首次发现创伤和电离辐射损伤发生的时间顺序能明显影响复合效应对成纤维细胞的损伤程度即:创伤发生在前能明显减轻电离辐射对细胞的损害,反之加重其对细胞的损害。而在肿瘤细胞中却未见类似现象。4.机械创伤能激活成纤维细胞内PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,并首次发现其下游的β-catenin和Nrf2两个转录因子同时上调,进一步证明β-catenin能调控成纤维细胞的干性,Nrf2可同时调控成纤维细胞的抗氧化能力和DNA损伤修复能力,进而增强了成纤维细胞的辐射抵抗。