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CCR4-NOT蛋白复合体是高度保守的多功能复合体,在基因表达调节过程中发挥重要作用。在细胞核中,该蛋白复合体主要参与染色质修饰、转录延伸、转录偶联过程中 DNA损伤修复等。在细胞质中,该复合物作为重要的去酰基化酶,在 mRNA的衰变、转录抑制和转录后调节过程中的翻译抑制起重要作用。此外,CCR4-NOT蛋白复合体也具有E3泛素连接酶活性,参与蛋白质降解。 CCR4-NOT蛋白复合体是独特的多亚基复合体。在酵母中,至少含有九种核心亚基:CCR4、CAF1、CAF40、CAF130和五种NOT蛋白(NOT1-5),存在1.0 MDa和2.0 MDa两种不同组成形式。在CCR4-NOT蛋白复合体结构中,NOT1蛋白作为支架蛋白,结合复合体中其他蛋白亚基,形成稳定的复合物。以 NOT1蛋白为诱饵,获得的低分辨率的电镜重构图显示,复合体的两臂近似 L-型。该蛋白复合体有两个酶催化组件:CCR4蛋白和CAF1蛋白相互作用,形成一个二元复合体,结合在NOT1蛋白的N末端区域,从而形成一个脱腺苷化组件;NOT2蛋白、NOT3蛋白、NOT4蛋白和NOT5蛋白都结合在NOT1蛋白的C末端区域,形成一个NOT组件。 本课题期望通过优化蛋白质纯化条件,得到更稳定、均一的高纯度酵母CCR4-NOT蛋白核心复合体,并制备高质量的冷冻电镜样品,收集高质量的冷冻电镜数据,最终确定CCR4-NOT蛋白核心复合体高分辨率空间结构模型,为深入分析CCR4-NOT蛋白复合体的生物学功能奠定结构信息基础。 本课题利用从EUROSCARF公司购买的酿酒酵母表达CCR4-NOT蛋白复合体,该复合体成员的NOT1蛋白N末端带有TAP标签。通过活化菌株以及酵母生长曲线的测定,在OD600吸光值为4-5左右收集菌体。采用高压破碎,IgG Sepharose TM6 Fast Flow亲和层析,钙调素亲和层析,蔗糖密度梯度离心等方法,纯化CCR4-NOT蛋白复合体。对纯化后的样品,进行western blot检测和质谱验证,制作负染电镜样品和冷冻样品。收集负染电镜数据,用EMAN2软件做二维平均观察初步结构信息,再通过三维重构,解析结构。 本课题经过反复尝试,确定可以得到CCR4-NOT蛋白复合体的纯化方法,并初步获得了该复合体的低分辨率的电镜结构。