研究背景甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,目前占全身内分泌肿瘤的首位,占全身恶性肿瘤发病的1%。但近年来其发病率增长迅速,已经成为人类恶性肿瘤发病率上升最快的肿瘤之一。超声不仅能提供结节的位置、数量、大小及形态,还能明确结节包膜是否完整,实性还是囊实性,是否伴有微钙化,与周围组织关系及颈部淋巴结的情况等特征。有些临床未能触及的肿块,常规超声均可探及,这对肿瘤的早期发现有非常重要的临床价值。高分辨超声优于常规超声,图像更加清晰,分辨率更高,已经普遍利用于甲状腺结节性疾病的筛查。但是超声在鉴别甲状腺结节的良恶性方面还存在一定的局限性。目前临床上对怀疑甲状腺恶性结节的患者最有效的术前诊断方法是穿刺活检细胞病理学检查。甲状腺穿刺活检细胞学检查(fine-needle aspiration,FNA)做为一种检查手段,操作方便、安全、微创,诊断快速准确性好,并发症少,被公认为甲状腺结节性质评估手段中的金标准；超声引导下细针穿刺抽吸活检(ultrasound-guided fine-needle aspiration US-FNA)是在超声引导下使用18G以下的细针对甲状腺结节进行反复穿插抽吸,获取细胞或组织,进行涂片或液基细胞液储存后制片,在显微镜下明确结节性质。甲状腺FNA的准确性数据有较大的差异,穿刺水平、细胞学诊断经验是常见的影响因素,除此之外,其他重要因素的存在也影响着FNA的准确性。寻找有效的辅助手段协助临床病理诊断,也是目前研究的热点。对于高分辨超声联合穿刺活检细胞学检查及免疫组化抗体标记物对于甲状腺癌鉴别诊断缺乏统一的标准,对于细胞学不易诊断的甲状腺癌病理组织分型的鉴别诊断尚不明确,且目前相关报道较少。研究目的1.探讨高分辨超声联合FNA免疫组化分析的方法对于甲状腺良恶性结节的诊断和鉴别诊断价值；2.分析细胞角蛋白(CK)-19、半乳糖凝集素(Galectin)-3, BRAF,HBME-1, TPO抗体的表达对于甲状腺结节尤其是甲状腺癌的诊断价值；3.探讨单纯FNA不易诊断的甲状腺癌病理分型的联合诊断新思路。资料与方法1.临床资料2015年10月至2016年2月于山东大学齐鲁医院(青岛)耳鼻喉头颈外科就诊的甲状腺结节患者38例,年龄25-67岁,平均36.7+9.6岁。38例患者共计结节45个,最大直径5.0-18.2mm,平均8.1±10.2mm。其中2个结节未取得满意数量组织,未进行免疫组化抗体标记,退出此研究。术后病理证实恶性结节25个,其中甲状腺乳头状癌22例,未分化癌1例,滤泡癌2例；良性结节18例,手术14例,其中9例为结节性甲状腺肿,4例腺瘤,1例桥本伴纤维化。其余4例未手术,定期随访。纳入本研究的所有患者均签署了介入性检查知情同意书。2.仪器与操作方法2.1高分辨超声检查及FNA筛选：2.1.1 采用Philips iU Eliter型彩色多普勒超声诊断仪,配置L12-5线阵探头,频率5.0-12.0MHZ。患者取仰卧,充分暴露颈部,对甲状腺进行横、纵、斜切多方位扫查。常规模式下记录结节的一般情况,包括结节位置、数量、大小、边缘、边界、形态、内部和后方回声特征、内部钙化、纵横比、周围及内部血供特点、周围组织改变、相应区域淋巴结等方面。2.1.2 2014年美国甲状腺协会(ATA)最新的指南中指出了超声检查对FNA的筛选有非常重要的作用,根据不同超声特征来评估甲状腺结节的恶性风险,将其分为高度恶性、中度恶性、低度恶性和极低度怀疑恶性以及良性,共5类,并给出了相对应的恶性概率。此研究分别对于超声评估高度、中度以及低度恶性的结节建议行FNA,结节直径均不小于5.0mm。2.2 FNA检查方法病人取仰卧头过伸位,充分暴露颈部,常规皮肤消毒,铺洞巾,0.5-1ml 2%利多卡因局部麻醉,术者左手持穿刺针,右手持探头在超声引导下对甲状腺结节进行2次细针穿刺,第一针用7号针头进行负压穿刺,取得组织进行涂片；第二针使用日本八光吸引活检针CL型23G×50mm,在超声引导下穿刺甲状腺结节,取得组织放入福尔马林保存液中。2.3免疫组化分析TBS洗涤,测定半乳凝集素-3、CK19. BRAF、HBME-1、TPO的免疫表达。①在细胞学检查确诊的良、恶性病例中,免疫组化指标仅作为参考。②在细胞学诊断为可疑恶性或不确定时,免疫组化表达为Galectin-3、CK19、BRAF、 HBME-1其中三项及以上阳性,TPO阴性,均作恶性结节诊断；当Galectin-3、 CK19、BRAF、HBME-1其中三项以上阴性、TPO阳性时,定义为良性结节诊断。3.统计学方法采用SPSS17.0统计软件包进行分析,计量资料采用X±S表示。采用单因素方差分析和独立样本t检验进行比较,,以1-特异度为横坐标,灵敏度为纵坐标构建受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线,评价各种诊断方法对于甲状腺良恶性结节的鉴别诊断价值,并采用正态性Z检验比较两者的曲线下面积(area under the curve, AUC);采用χ2检验分析高分辨超声、FNA、 FNA联合免疫组化对甲状腺良恶性结节的鉴别诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.细胞学诊断联合免疫组化与术后病理对照：术前细胞学诊断为乳头状癌者17例,未分化癌1例,滤泡性肿瘤(可疑恶性8例),滤泡性病变(可疑良性7例)。8例细胞学诊断为可疑恶性的病例,结合免疫组化抗体标记,3例诊断为乳头状癌,1例滤泡癌；术后病理证实4例乳头状癌,1例滤泡癌。7例细胞学诊断为可疑良性的病例,结合免疫组化抗体标记,4例诊断为恶性,术后病理证实2例乳头状癌,1例滤泡癌。最后术后病理确定为乳头状癌22例,未分化癌1例,滤泡状癌2例,腺瘤4例,结节性甲状腺肿9例,桥本伴纤维化1例。2.不同的免疫组化标记在甲状腺癌中的诊断价值比较：Galectin-3在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(positive predictive value, PPV)阴性预测值(negative predictive value, NPV)分别为84.0%、90.9%、90.7%、96.7%、76.9%。CK19在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV分别为84.0%、89.3%、93.0%、89.5%、78.6%。BRAF在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV分别为84.0%、91.7%、90.7%、87.5%、73.3%。HBME-1在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV分别为93.1%、81.8%、83.7%、93.1%、69.2%。TPO在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV分别为93.7%、72.7%、90.7%、86.1%、73.2%。联合标记抗体在甲状腺癌诊断中的敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV分别为90.6%、95.6%、93.0%、90.6%、73.2%。3.高分辨超声、FNA及FNA联合免疫组化在甲状腺良恶性结节中的鉴别诊断价值比较：高分辨超声鉴别诊断甲状腺良恶性结节的敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性分别为72.2%、74.5%、68.5%、69.5%、75.4%。FNA鉴别诊断甲状腺良恶性结节的敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性分别为75%、78.7%、85.7%、73.5%、86.5%。FNA联合免疫组化鉴别诊断甲状腺良恶性结节的敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性分别为93.7%、90.9%、93.7%、77.8%、93.0%。FNA及FNA联合免疫组化对于鉴别甲状腺良恶性结节的敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性均高于常规超声；FNA联合免疫组化对于甲状腺结节鉴别诊断的敏感性、PPV、NPV、准确性均高于单纯FNA。4.高分辨超声、FNA、FNA联合免疫组化标记物抗体鉴别诊断甲状腺良恶性结节的ROC曲线分析：高频超声鉴别诊断甲状腺良恶性结节的AUC为0.807,FNA鉴诊断甲状腺良恶性结节的AUC为0.930,FNA联合免疫组化标记物抗体鉴别诊断甲状腺良恶性结节的AUC为0.989。5.甲状腺良恶性结节鉴别诊断,FNA与高频超声的ROC曲线下面积比较,差异具有统计学意义(Z=2.70,P=0.017) ; FNA联合免疫组化与高频超声的ROC曲线下面积比较,差异具有统计学意义(Z=3.18,P=0.009) ; FNA与FNA联合免疫组化对于甲状腺良恶性结节鉴别诊断的ROC曲线下面积比较,差异无统计学意义(Z=1.23,P=0.083)。提示FNA与FNA联合免疫组化鉴别诊断甲状腺良恶性结节的意义相近,差别较小,但FNA联合免疫组化敏感性、特异性、PPV高于单纯FNA,但NPV却低于单纯FNA。6.高分辨超声诊断提示滤泡性肿瘤2例,FNA细胞学检查阳性1例,阴性1例。阳性者提示Galectin-3、CK19、BRAF、HBME-1均为阳性,TPO阴性,细胞学结果仍提示滤泡性肿瘤,不除外滤泡癌,最后病理证实为甲状腺滤泡癌。但FNA阴性1例,免疫组化也为阴性,但最后病理证实仍为甲状腺滤泡癌。结论FNA及FNA联合免疫组化抗体标记对于甲状腺良恶性结节的诊断及鉴别诊断具有重要的临床价值,可提高甲状腺癌的诊断敏感性、阳性预测值、阴性预测值、准确率。Galectin-3、CK19、BRAF、HBME-1抗体对于甲状腺癌的诊断敏感性、特异性、准确性、PPV、NPV均较高,可以作为甲状腺癌的特异性标记抗体。有望对于单纯FNA较难诊断的甲状腺滤泡癌,提供新的诊断思路和新的辅助诊断方法。FNA在甲状腺结节尤其是甲状腺癌的准确诊断中占据重要的地位,FNA联合免疫组化在甲状腺癌的诊断方面展现了很好的发展前景。