腈水解酶是属于腈水解酶超家族的一类重要的工业酶,它能够将廉价易制备的腈类底物水解成为高附加值的羧酸。在α-羟基酸,如(R)-(-)-扁桃酸的合成中表现出巨大的应用潜力。但是由于受到空间位阻效应的影响,腈水解酶在(R)-(-)-邻氯扁桃酸的制备方面表现的却不尽如人意,使其工业化的应用受到限制。此外,目前国内外对腈水解酶的研究虽然很多,但是被报道的能够生成(S)-(+)-扁桃酸的腈水解酶只有4个,且其对映体选择性很低(<30%)。为了解决上述问题,本课题致力于新型芳基乙腈类腈水解酶资源的开发,采用传统的Genome mining的方法构建了一个腈水解酶库,从中得到来源于Luminiphilus syltensisNOR51-B的对邻氯扁桃腈具有高活力和高对映体选择性的重组腈水解酶GPnor51和来自Pseudomonas psychrotolerans L19具有S型选择性的腈水解酶PpL19。具体研究结果如下：首先,采用传统的数据挖掘的方法,以对扁桃腈具有较高水解能力和对映体选择性的来源于Burkholderia cenocepaciaJ2315的腈水解酶为模板,对数据库进行检索,构建了一个包含43个不同来源的小型腈水解酶库,为后续针对不同底物的筛选奠定了基础。(1)高活性和高对映体选择性邻氯扁桃腈腈水解酶的筛选及酶学性质鉴定以邻氯扁桃腈为底物进行筛选,从酶库中得到的来源于Luminiphilus syltensis NOR51-B的重组腈水解酶GPnor51,展现出最高的催化活力(14.2 U/mg)和对映体选择性(98.2%)。通过酶学性质研究,该酶呈现出很好的温度和pH稳定性。通过对底物谱的研究发现腈水解酶GPnor51具有较宽的底物谱,除了能够降解芳基乙腈类腈底物,还能水解其它如杂环类腈、二腈以及某些脂肪腈类底物。通过对其反应动力学参数进行检测,发现该酶以邻氯扁桃腈为底物时,Km值仅为0.38 mM,说明腈水解酶GPnor51对邻氯扁桃腈具有较强的亲和力。腈水解酶GPnor51同时对扁桃腈衍生物(邻、间及对位的卤素取代)也有较高的水解活力和对映体选择性,在扁桃酸及其衍生物的生产方面具有极高的应用潜力。(2)重组腈水解酶GPnor51水解邻氯扁桃腈生成(R)-(-)-邻氯扁桃酸的应用为了实现高浓度高对映体选择性生产光学纯(R)-(-)-邻氯扁桃酸,首先考察了7种水溶性有机溶剂对腈水解酶GPnor51的酶活和对映体选择性的影响。结果显示加入有机溶剂后,腈水解酶GPnor51的酶活损失严重。而对映体选择性的变化更加显著,甚至出现了选择性反转的现象。在构建的两相体系中,也未得到理想的结果。又对重组腈水解酶GPnor51细胞进行了固定化,结果发现该酶经固定化后用于催化50 mM底物浓度的反应中,重复使用10批次后酶活仍为原来的90%左右,产物最终浓度达到458 mM (85 g/L),ee值为97.9%,实现了(R)-(-)-邻氯扁桃酸的高浓度生产。(3)具有S型选择性腈水解酶的筛选及定向进化以(S)-(+)-扁桃酸为目的产物,从酶库中得到了一株来源于Pseudomonas psychrotolerans L19具有S型选择性的重组腈水解酶PpL19,ee值为52.7%。为了提高该酶的S型对映体选择性,分别采取了随机突变、定点突变、单点饱和突变等手段对腈水解酶PpL19进行定向改造,得到了多个在不同位点发生突变且表现出不同选择性的突变体。此外还对4个与该酶的对映体选择性密切相关的氨基酸热点进行了鉴定和表征,分别为M113, R128, A136和1168。最终通过将有益位点的联合突变得到了选择性提高到91.1%的突变体PpL19-LH,是目前文献报道的第一个对扁桃腈具有较高S型选择性的腈水解酶,为(S)-(+)-扁桃酸的腈水解酶一步法生产奠定了基础。另外,在此过程中,还得到了选择性反转为R型的突变体PpL19-GYY,并且其ee值也达到90%以上,为新型生物催化剂的挖掘提供了一种新的思路和方法。(4)腈水解酶PpLl9及其突变体的同源建模及分子对接分析为了对腈水解酶突变体选择性的变化做出合理的解释,以便对后续的进一步改造加以指导,构建了腈水解酶PpL19的同源模型,并分别采用了Ramachandran plot和Profile-3D对模型进行评估,确保所得到的三维模型的可信度,为后续的分子对接奠定基础。然后将腈水解酶PpL19及其突变体分别与底物(R)/(S)-扁桃腈进行分子对接。从底物与催化位点之间的距离和氢键的形成两个方面对对接模型进行了分析,对腈水解酶PpL19对映体选择性的变化做出了解释,对其它芳基乙腈类腈水解酶对映体选择性方面的定向改造具有一定的指导作用。