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目的：通过间歇腹腔注射硝酸甘油（Nitroglycerin，NTG）建立慢性偏头痛（Chronic migraine，CM）大鼠模型，研究腹外侧中脑导水管周围灰质（the ventrolateral Periaqueductal Gray，vlPAG）的结构与功能变化；通过腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体将脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）于vlPAG局部高表达，研究对CM大鼠模型的保护作用。
方法：1.将20只雄性SD大鼠随机分成2组，一组按体重10mg/kg隔天腹腔注射NTG（9天共5次注射）诱导成CM模型，另一组同期腹腔注射生理盐水。使用辐射热刺激器检测腹腔注射NTG3小时内以及第1、3、5、7、9天每次腹腔注射NTG1小时后大鼠的爪撤回潜伏期（Paw withdrawal latency，PWL）；最后一次腹腔注NTG1小时后，运用免疫组化检测三叉神经尾侧亚核（Trigeminal nucleus caudalis，Sp5C）c-Fos及三叉神经节降钙素相关基因肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）的表达。2.将105只雄性SD大鼠随机分为7组：生理盐水对照组，CM模型组12h，24h，72h，7d，14d，21d，每组大鼠15只。隔天给药5次后，每个亚组在相应的时间点灌注取中脑组织实施尼氏染色，蛋白印迹实验（Western Blot，WB）和免疫荧光染色实验（Immunofluorescence，IF），分析vlPAG区神经元的囊泡型谷氨酸转运体-1（Vesicular Glutamate Transporter1,vGLUT1）和囊泡型γ-氨基丁酸转运（Vesicular GABA Transporter,vGAT）在不同时间点表达水平的变化。3.运用脑立体定位技术，分别于vlPAG区注射携带BDNF及绿色荧光蛋白（Green fluorescent protei，GFP）基因的重组AAV和阴性腺相关病毒（nagative Adeno-associated virus，NAAV），手术21天后荧光镜下观察vlPAG区绿色荧光蛋白表达情况，并通过WB检测每组第1周、2周、3周vlPAG区BDNF蛋白表达水平变化。将40只雄性SD大鼠于vlPAG区分别导入携带BDNF基因的AAV（BDNF AAV）和NAAV，手术第14天后开始隔天注射NTG或生理盐水（9天内共5次注射），每次腹腔给药1小时后使用辐射热刺激器检测每组大鼠的PWL，并用视频记录每组大鼠1小时内的饶头次数用以分析vlPAG局部BDNF高表达对CM模型的保护作用。
结果：1.CM模型的PWL在腹腔注射NTG后第1小时降低最明显，且在9天内成逐渐下降的趋势。CM组Sp5C区Fos阳性蛋白计数以及三叉神经节的CGRP阳性蛋白百分比均显著高于正常对照组（P<0.001）。2.相比于生理盐水对照组，CM组在第12h、24h、72h时间点vlPAG区神经细胞呈现胞体水肿，体积增大，轴突处胶质细胞增生；在第7d、14d、21d时间点尼氏小体散在分布，胞质淡染，数量减少。CM模型vlPAG区vGLUT1和vGAT表达水平在最初的24h内呈现明显升高的趋势，在24h后呈现逐渐下降的趋势，直到第21天仍较对照组稍高。CM模型vlPAG区的vGLUT1和vGAT在第24h的WB标准化比值和平均荧光密度均显著高于其他亚组（P<0.01）。CM形成后的第12h、24h、72h和7d时间点vlPAG区的vGLUT1和vGAT的WB标准化比值以及平均荧光密度相比于生理盐水对照组均有显著性差异（P<0.01）。3.荧光显微镜下vlPAG区发出绿色荧光，WB定量实验分析得出：相比于NAAV组、正常对照组，BNNF AAV组在第1周、2周、3周vlPAG区的BDNF表达明显增高（P＜0.01），且表达量逐周递增。注射携带BDNF AAV的慢性偏头痛模型组较注射NAAV慢性偏头痛组、BDNF AAV生理盐水组、NAAV生理盐水组在爪撤回潜伏反应时及饶头次数上均有显著性差异（P＜0.01）。
结论：本研究表明慢性偏头痛大鼠模型造成vlPAG结构改变和功能失调，vlPAG局部BDNF高表达对慢性偏头痛具有保护作用。
方法：1.将20只雄性SD大鼠随机分成2组，一组按体重10mg/kg隔天腹腔注射NTG（9天共5次注射）诱导成CM模型，另一组同期腹腔注射生理盐水。使用辐射热刺激器检测腹腔注射NTG3小时内以及第1、3、5、7、9天每次腹腔注射NTG1小时后大鼠的爪撤回潜伏期（Paw withdrawal latency，PWL）；最后一次腹腔注NTG1小时后，运用免疫组化检测三叉神经尾侧亚核（Trigeminal nucleus caudalis，Sp5C）c-Fos及三叉神经节降钙素相关基因肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）的表达。2.将105只雄性SD大鼠随机分为7组：生理盐水对照组，CM模型组12h，24h，72h，7d，14d，21d，每组大鼠15只。隔天给药5次后，每个亚组在相应的时间点灌注取中脑组织实施尼氏染色，蛋白印迹实验（Western Blot，WB）和免疫荧光染色实验（Immunofluorescence，IF），分析vlPAG区神经元的囊泡型谷氨酸转运体-1（Vesicular Glutamate Transporter1,vGLUT1）和囊泡型γ-氨基丁酸转运（Vesicular GABA Transporter,vGAT）在不同时间点表达水平的变化。3.运用脑立体定位技术，分别于vlPAG区注射携带BDNF及绿色荧光蛋白（Green fluorescent protei，GFP）基因的重组AAV和阴性腺相关病毒（nagative Adeno-associated virus，NAAV），手术21天后荧光镜下观察vlPAG区绿色荧光蛋白表达情况，并通过WB检测每组第1周、2周、3周vlPAG区BDNF蛋白表达水平变化。将40只雄性SD大鼠于vlPAG区分别导入携带BDNF基因的AAV（BDNF AAV）和NAAV，手术第14天后开始隔天注射NTG或生理盐水（9天内共5次注射），每次腹腔给药1小时后使用辐射热刺激器检测每组大鼠的PWL，并用视频记录每组大鼠1小时内的饶头次数用以分析vlPAG局部BDNF高表达对CM模型的保护作用。
结果：1.CM模型的PWL在腹腔注射NTG后第1小时降低最明显，且在9天内成逐渐下降的趋势。CM组Sp5C区Fos阳性蛋白计数以及三叉神经节的CGRP阳性蛋白百分比均显著高于正常对照组（P<0.001）。2.相比于生理盐水对照组，CM组在第12h、24h、72h时间点vlPAG区神经细胞呈现胞体水肿，体积增大，轴突处胶质细胞增生；在第7d、14d、21d时间点尼氏小体散在分布，胞质淡染，数量减少。CM模型vlPAG区vGLUT1和vGAT表达水平在最初的24h内呈现明显升高的趋势，在24h后呈现逐渐下降的趋势，直到第21天仍较对照组稍高。CM模型vlPAG区的vGLUT1和vGAT在第24h的WB标准化比值和平均荧光密度均显著高于其他亚组（P<0.01）。CM形成后的第12h、24h、72h和7d时间点vlPAG区的vGLUT1和vGAT的WB标准化比值以及平均荧光密度相比于生理盐水对照组均有显著性差异（P<0.01）。3.荧光显微镜下vlPAG区发出绿色荧光，WB定量实验分析得出：相比于NAAV组、正常对照组，BNNF AAV组在第1周、2周、3周vlPAG区的BDNF表达明显增高（P＜0.01），且表达量逐周递增。注射携带BDNF AAV的慢性偏头痛模型组较注射NAAV慢性偏头痛组、BDNF AAV生理盐水组、NAAV生理盐水组在爪撤回潜伏反应时及饶头次数上均有显著性差异（P＜0.01）。
结论：本研究表明慢性偏头痛大鼠模型造成vlPAG结构改变和功能失调，vlPAG局部BDNF高表达对慢性偏头痛具有保护作用。