随着人类基因组计划的完成，蛋白质的结构功能关系成为生物学研究的前沿问题。其中蛋白质的翻译后修饰过程，如甲基化、酰基化、磷酸化和糖基化受到科研工作者的广泛关注。获得高度纯度的目标蛋白是该研究得以开展的前提。传统生物表达法只能得到有天然氨基酸组成的蛋白质，因此远远不能满足当前的研究需要。最近，美国Scripps研究所的Schultz等发展出人工编码非天然氨基酸技术，实现了含有非天然氨基酸的蛋白质的非经典生物表达，并在组蛋白、G蛋白等一列重要生物体系得到广泛的应用。然而，该技术表达蛋白的效率低，同时插入非天然氨基酸的种类有限。化学法合成蛋白质能够实现任意位点嵌入任一结构的非天然氨基酸，因此被认为是获得翻译后修饰蛋白质最有力手段之一。上世纪初，自然化学连接技术被美国芝加哥大学Kent等人发现，并成功用于数百个蛋白质的化学合成。自然化学连接反应是基于硫酯肽与N端Cys肽发生的化学选择性形成酰胺键反应而发展的一种新型合成方法。自然化学连接反应能够不仅能够实现化学全合成蛋白，还能实现半合成蛋白质。但是，其中硫酯肽对哌啶不稳定，不能直接采用Fmoc法固相合成，而采用Boc法固相合成。Boc法固相合成却由于采用高度危险性的HF和对多种修饰蛋白的局限性，主要体现在磷酸化和糖基化蛋白，而不能被广泛应用。Fmoc法固相合成因反应条件温和而被广泛的使用。市场上的固相合成仪绝大多数均基于Fmoc法而设计的，而Boc法极少被人所用。目前，虽然已经发展出了十几种采用固相掩蔽的策略实现硫酯的Fmoc法固相合成的方法，却都存在硫酯化效率低和连接臂合成困难的问题。本文作者发展出酰肼连接反应合成蛋白质的技术，完成两段法合成Trifolixion、N端到C端四段法合成CssII和结合Intein技术半合成蛋白LC3。多肽酰肼能够采用Boc法和Fmoc法高效地合成，而且能够实现N到C端的四片段肽连接反应。此外，作者将2-叔丁基二硫乙氧羰基（TBEO）用于保护Thz，解决了C端到N端的酰肼多段连接技术，实现了六段全收敛式化学合成由142氨基酸组成的核糖体蛋白RPS25。