4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶,4-coumarate:coenzyme A ligase;)是连接苯丙烷代谢与木质素生物合成的交叉点酶,CCR(肉桂酰辅酶A还原酶,cinnamoyl-Co A reductase)是木质素特异生物合成的第一个酶,也是木质素生物合成的第一个限速酶。调控这两个基因的表达会影响植物体内“碳流”的流向。将这两个酶连接形成的双功能酶4CL1-CCR已在体外和原核生物体内证明了具有催化活性。但是外源基因在植物体内发挥的作用与其在原核生物中存在一定的差异,因此本研究在烟草中异源表达毛白杨的融合基因4CL1-CCR,对转基因烟草植株和悬浮细胞中木质素含量及沉积状态进行分析,并通过转录组分析阐述了融合基因影响烟草悬浮细胞木质化的过程。本研究得到了以下主要研究结果:(1)经硫代硫酸解结合高效气相色谱质谱联用对转基因烟草木质素单体含量分析发现,异源表达4CL1-CCR融合基因,不仅增加了烟草细胞壁中木质素的总含量,也可以改变木质素单体的组成。转基因烟草中G型木质素单体含量为14.34±0.52μg/mg显著高于WT的10.51±0.03μg/mg,但S型木质素的含量变化并不一致。(2)对转基因烟草茎的不同部位进行盐酸-间苯三酚染色发现,在转基因烟草茎顶端(幼嫩组织)木质部木质化的细胞已经成为一个闭合环状,而WT(野生型对照组)中相同位置并非所有细胞都表现出木质化的染色反应。对转基因烟草成熟组织进行染色观察发现,转基因烟草木质部宽度和导管内壁周长显著增加。(3)利用拉曼光谱技术对转基因烟草茎木质化的细胞进行mapping分析发现,转基因烟草木质素高密度沉积区的面积较WT有所升高,但分布区域仍为复合胞间层和细胞角隅;在次生细胞壁中木质素的沉积状态表现为低密度沉积。说明转入的融合基因增加了细胞壁中的木质素含量但并未改变木质素在细胞壁中的密度分布。(4)对转基因烟草悬浮细胞进行继代培养(MS+2,4-D 1.0mg/L),发现外源基因没有影响到细胞生长周期,转基因悬浮细胞与WT有相同的生长曲线。但外源表达4CL1-CCR使得转基因悬浮细胞木质素积累提前,在继代培养第11天时转基因悬浮细胞已经可以观察到木质素的盐酸-间苯三酚染色反应,并且在继代培养到24天时染色反应加深,而WT细胞系在培养24天时依然不能被染色。应用GC-MS技术检测到在继代培养24天时的转基因烟草悬浮细胞中积累了少量G型木质素。通过对烟草发育的不同过程中木质素单体分析发现,转基因和WT烟草的发育过程中均为先积累G型木质素,然后随着组织的逐渐成熟S型木质素开始沉积到细胞壁区域内,并最终使G:S趋近于1。(5)通过RNA-seq对WT和转基因悬浮细胞不同继代培养时长的基因表达进行分析,结果显示在转基因烟草悬浮细胞中参与木质素合成的多个基因表达量有不同程度的上调。负责烟草细胞初生壁和次生壁中纤维素合成的基因表达量均有不同程度的下调,推测会使纤维素的合成减弱。在对生长素转运蛋白AUX家族成员基因的表达分析发现,转基因烟草悬浮细胞中此家族成员基因的表达受到严重抑制,阻碍了外源添加的2,4-D向细胞内转运,胞内低浓度生长素无法激活生长素响应因子(auxin response factor),最终导致生长素信号传导途径的下游目标基因表达受影响。对烟草木质素合成基因相关转录因子分析发现烟草的myb-releated protein 306和myb-releated protein 315表达量升高,其中myb-releated protein 306可能参与调控了细胞由增殖向分化的转化过程,myb-releated protein 315则直接参与调控木质素单体合成相关基因的表达,最终使转基因悬浮细胞出现较早的木质素沉积现象。本实验通过将融合基因转入烟草中补充了融合基因在植物体内发挥作用的实验数据,并利用悬浮细胞结合转录组分析从分子角度解释了融合基因4CL1-CCR对烟草细胞形态及木质化过程的影响。