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第一部分CD39在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用目的:最近研究表明星形胶质细胞释放5’-三磷酸腺苷(5’-adenosine triphosphate,ATP)不足可能是重度抑郁症(major depressive disorder,MDD)的一种病理生理学机制。当ATP从细胞内释放进入细胞间隙后,会迅速被细胞膜上的外核苷三磷酸双磷酸酶(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase,ENTPD)水解。然而ENTPD在抑郁症中的作用却从未有过报道,因此我们将研究ENTPD1(也称为CD39)在慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress,CSDS)所致小鼠抑郁样行为中的作用。方法:在CSDS小鼠抑郁模型的基础上,通过实时荧光定量PCR(real-time Quantitative PCR,qPCR)、western blot检测CSDS敏感小鼠海马和内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)ENTPD mRNA 和蛋白的表达水平;使用免疫组化技术确定CD39在海马脑区表达的细胞类型;使用孔雀绿磷酸盐检测试剂盒和生物发光ATP检测试剂盒分别检测细胞外ATP水解酶活性和细胞外ATP浓度;通过立体定位小鼠侧脑室或海马微量注射CD39类似物及ATP或CD39抑制剂,观察其对抑郁样行为的作用。基因沉默海马CD39,观察其对细胞外ATP水解酶活性、ATP浓度及抑郁样行为的作用。结果:(1)CSDS敏感小鼠海马脑区CD39 mRNA水平上调至1.39± 0.050(n = 7-9 mice,P<0.001)、蛋白表达水平增加至 1.58± 0.063(P<0.001),细胞外 ATP水解酶活性由 2.23 ± 0.19 nmol of Pi release/min/mg protein 升高至 3.54 ±0.30 nmolofPirelease/min/mgprotein(P<0.01),而 mPFC 脑区上述指标均没有显著变化。(2)CD39在海马神经元和星型胶质细胞表达丰富,在小胶质细胞低表达。(3)侧脑室和海马脑区给予CD39功能类似物apyrase诱导社会逃避行为和快感缺失。小鼠侧脑室给予apyrase(80U/ml)后社会接触时间由54.6±5.2s降至 19.2±5.2s(P<0.01),糖水偏好率由 84.83±4.10%降至 60.27±5.06%(P<0.01);小鼠海马脑区给予apyrase(40 U/ml)后社会接触时间由46.2±4.0 s降至19.5±3.4 s(P<0.001),糖水偏好率由 86.5± 1.46%降至 63.0±4.27%(P<0.001)。当再次给予ATP(2 5μmol/L)后则缓解apyrase诱导的抑郁样行为,社会接触时间由28.9±5.9s增至54.5 ± 8.6 s(P<0.05)。(4)CSDS敏感小鼠侧脑室或海马脑区给予CD39抑制剂ARL67156改善CSDS诱导的抑郁样行为。侧脑室给予ARL67156使CSDS敏感小鼠社会接触时间由9.1 ± 3.0 s增加至38.6± 5.9 s(P<0.01),糖水偏好率由55.10±6.72%增加至80.72±3.21%(P<0.001)。海马脑区给予ARL67156使CSDS敏感小鼠社会接触时间由24.5 ± 3.6 s升高至41.8 ± 5.3 s(P<0.05)。(5)沉默CSDS敏感小鼠海马脑区CD39基因,降低细胞外ATP水解酶活性,增加细胞外ATP浓度,发挥抗抑郁作用,具体表现为:使细胞外ATP水解酶酶活性由 5.82±4.49 nmol of Pi release/min/mg protein 减弱为 4.09 ± 0.44 nmol of Pi release/min/mg protein(P<0.05),细胞外 ATP 浓度由 0.82 ± 0.22 nM mg-1上升至2.50 ± 0.53 nM mg-1(P<0.01),社会接触时间由19.9 ±4.0 s增至56.8±7.3 s(P<0.001)。结论:CSDS增强小鼠海马CD39的表达及活性,通过增加ATP水解诱导抑郁样行为。海马CD39功能异常可能是抑郁症病理生理学的分子机制,提示CD39可能成为抑郁症治疗的新靶点。第二部分CD39介导慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为的机制目的:已报道,慢性应激导致海马神经再生能力下降,也使海马树突结构和树突棘发生改变,增加海马神经再生可能成为治疗抑郁症的新策略。而CD39可能通过调节细胞外ATP浓度影响神经可塑性。因此我们研究CD39在CSDS条件下对海马神经再生及树突棘的作用。方法:通过免疫组化标记海马的分裂细胞和未成熟神经元,以这两种细胞的数量来反应海马神经再生的状况;小鼠侧脑室微量注射CD39抑制剂观察其对神经再生的作用;用携带绿色荧光蛋白的慢病毒转染海马神经元,用共聚焦成像及三维重构技术分析海马树突棘,观察慢性应激和沉默CD39基因对树突棘数量的影响。结果:(1)CSDS导致海马神经再生降低,海马分裂细胞和未成熟神经元数量显著下降,BrdU免疫阳性细胞(分裂细胞)数从1120±66降低至740±109(P<0.05),BrdU/DCX免疫阳性细胞(未成熟神经元)数从568±66降低至285 ±56(P<0.05)。CSDS敏感小鼠侧脑室给予CD39抑制剂ARL67156显著增加这两种细胞数量,促进海马神经再生,BrdU免疫阳性细胞数从2700 ± 150增加至3985± 268(P<0.01),BrdU/DCX免疫阳性细胞从 1150±25增至 1770± 164(P<0.01)。(2)CSDS使总树突棘密度从2.9 ±0.2μm-1下降2.3 ±0.1μm-1(P<0.05),而沉默CD39使减少的总树突棘恢复至2.8 ± 0.2 μm-1(P<0.05)。将树突棘分为3种亚型后发现,慢性应激只导致stubby型树突棘从1.2±0.1μm-1减少至0.7±0.1μm-1(P<0.01),对mushroom和thin两种类型树突棘没有显著影响,而沉默CD39使减少的stubby型树突棘恢复至1.4±0.1 μm-1(P<0.001)。结论:CSDS导致海马神经再生下降,海马树突棘减少,而抑制CD39则增加海马神经再生,基因沉默海马CD39使减少的树突棘恢复。抑制CD39改善慢性应激导致的神经可塑性异常,这可能是CD39介导抑郁样行为的神经生物学机制。