背景与目的泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内主要的蛋白质降解系统,其参与许多调节重要生命过程的蛋白质的降解。蛋白酶体已经成为包括肿瘤在内的多种疾病发生发展过程中重要的作用靶点,因此蛋白酶体抑制剂则成为了众多学者研究的热点。蛋白酶体抑制剂包括天然蛋白酶体抑制剂和合成蛋白酶体抑制剂。天然蛋白酶体抑制剂包括乳胞素(Lactacystin)、环孢菌素(CsA)、Epoxomicin、DCI等;合成蛋白酶体抑制包括醛基肽类(MG132、MLN519等)以及硼酸肽类(Bortezomib、2-aminobenzyls等)。目前,合成蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,PS341)已被美国FDA批准用于血液系统肿瘤Myelomade的治疗,也是首个用于临床治疗的蛋白酶体抑制剂。临床研究显示硼替佐米具有良好的抗肿瘤效果,同时也会产生一定的毒副作用。为了取得最佳治疗效果,临床肿瘤治疗中常将两种或者更多种相互间具有增效减毒的抗肿瘤药物联合应用,即联合化疗。基于联合化疗原则,寻找能够增加硼替佐米抗肿瘤作用的药物将有很大的临床意义。本研究在实验室前期筛选的基础上,选定临床抗风湿药金诺芬(Auranofin, Aur)作为蛋白酶体抑制剂的增敏剂,通过体内体外实验,研究其能否增加蛋白酶体抑制剂(MG132、PS341)的抗肿瘤作用,并初步探讨增敏作用产生的机制,为两类药物的临床联合应用提供实验依据。方法1、细胞活力测定:采用MTS方法检测金诺芬、蛋白酶体抑制剂MG132及两者联合对细胞生长和细胞增殖能力的影响。2、细胞凋亡检测:荧光显微镜检测细胞形态学变化及Annexin V-FITC、PI双染色后拍照记录细胞死亡情况。3、蛋白检测:采用Western blot方法检测金诺芬与蛋白酶体抑制剂MG132联合作用对细胞的Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9及PARP的影响。4、在体抗肿瘤作用检测:采用H22小鼠异体移植肿瘤模型,观察金诺芬与蛋白酶体抑制剂PS341联合作用对肿瘤生长的抑制作用。结果(一)金诺芬及蛋白酶体抑制剂MG132对人乳腺癌细胞MCF-7细胞活力的影响1、金诺芬与蛋白酶体抑制剂MG132联合作用对MCF-7细胞的增殖抑制作用实验用MG132浓度分别为2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L ,Aur浓度分别为0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L。其中MG132 2μmol/L分别与Aur 0.3μmol/L、0.4μmol/L联合组, MG132 3μmol/L与Aur 0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L联合组,4μmol/L MG132与Aur 0.2μmol/L联合组对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖有明显的抑制作用,作用明显强于单独应用MG132,Aur组,两者之间呈增敏关系。2、金诺芬与蛋白酶体抑制剂MG132对MCF-7细胞的死亡诱导作用MG132 3μmol/L、4μmol/L分别与Aur 0.3μmol/L,0.4μmol/L联合组死亡率明显增多。荧光显微镜下观察显示MG132 3μmol/L与金诺芬0.4μmol/L联合组PI及FITC阳性细胞数最多。3、金诺芬与蛋白酶体抑制剂MG132对Caspacse系统的活化作用单药时蛋白表达变化不明显,而MG132 3μmol/L与Aur 0.3μmol/L联合作用24小时后Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9前体的表达明显下调,同时PARP的P89切割带明显增多。(二)金诺芬及PS341在体抗肿瘤作用PS341组,Aur组以及PS341+Aur组的平均肿瘤重量均小于对照组肿瘤重量,联合给药组的小鼠平均肿瘤重量明显小于单独给药组小鼠的肿瘤重量,联合给药组小鼠肿瘤抑制率明显高于两单独给药组小鼠肿瘤抑制率。结论1.金诺芬(Aur)能够增强蛋白酶体抑制剂(MG132, PS341)的抗肿瘤效果。2.金诺芬增敏蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤效应与Caspase系统的活化有关。