成体骨髓间充质干细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠的研究

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目的:(1)探讨成体大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)生物学特性;(2)体外诱导MSCs向神经元样细胞分化;(3)制作大鼠帕金森病(PD, Parkinson’s disease)模型;(4)移植MSCs治疗大鼠PD,探讨MSCs治疗PD大鼠的可行性及可能的机制。方法:(1)MSCs扩增纯化后,计数培养板中细胞数量,测定生长速度;应用流式细胞仪测定分化前后细胞周期;利用膜片钳技术,了解分化前后细胞的电生理性质。(2)用bFGF联合N2诱导MSCs分化为神经元样细胞,对分化后细胞行免疫细胞化学染色鉴定。(3)应用大鼠立体定向仪,向大鼠内侧前脑束微量注射6-OHDA,制作大鼠PD模型。(4)15只PD大鼠,随机分为2组,一组移植Brdu标记的MSCs到模型大鼠的纹状体内(n=11),一组注射PBS(n=4)到相同靶点处。术后4个月中定期对大鼠进行旋转实验测试,并分别在术后2周和4月时进行脑内针道处免疫组化TH和Brdu检测。结果:(1)应用贴壁培养筛选法体外完全可以培养出大鼠骨髓MSCs,当MSCs接种浓度为2×103/ml时,在标准条件下,约6天可以增殖4倍。在MSCs无血清DMEM/F12培养液中加入bFGF和N2,可以诱导MSCs分化为神经元样细胞,72小时分化率达95.6%,免疫细胞化学染色显示神绎元样细胞NESTIN、NSE、NF阳性表达,流式细胞仪测定分化后细胞G0/G1期97.5%,而分化前细胞S+G2/M期23.7%。但分化前后细胞电生理检测中没有检测到明显的动作电位。(2)注射6-OHDA 12μg到大鼠内侧前脑束,通过大鼠的旋转实验测试,有16只大鼠制模成功,成功率为23.8%,成功大鼠模型的毁损侧黑质处TH阳性神经元仅占正常侧毁损侧3.8%。(3)Brdu标记的MSCs移植到模型大鼠的纹状体内,术后2周及4月时移植针道处及针道周围可见外源性Brdu阳性MSCs,并有外源性细胞表达TH。细胞移植组的PD大鼠症状较PBS注射组行为学也明显改善。结论:(1)骨髓MSCs取材容易,易于体外培养,并可以向神经元样细胞分化。(2)通过注射6-OHDA到大鼠脑内,可以成功制作出PD模型。(3)移植成体骨髓MSCs到大鼠PD模型的纹状体内可以改善PD模型大鼠的症状,且表达TH蛋白。
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