原发性肝癌，是世界第五大常见肿瘤，死亡率高居第三，在中国则高居第二。尽管肝癌的治疗手段包括化学治疗、放射治疗、肝脏规则性切除、肝移植及局部治疗等已有了很大的进展，但肝癌病人的预后还是很差，即使根治术后5年生存率仅17％-53％，而且复发率很高。造成肝癌预后差的原因主要有两个:其一是常规的化疗对肝癌几乎无效;其二是现有的早期诊断指标存在不足，超过80％的患者就诊时已处于进展期而失去最佳的手术切除机会。肝癌特异性的更早期的标记物可以发现更早期的病人，就会有时间提供更早的干预治疗，改善病人的预后。尽管目前对肝癌发生、发展相关的基因研究已经有了很大的进步，但是还没有找到解决肝癌患者更早期诊断得有效办法，以改善预后。因此研究肝癌病例中异常表达的特异性分子标记物，将有助于肝癌的早期发现病人和改善预后。　　MicroRNAs是近年来发现的一类重要的基因调节分子，成熟的miRNAs是一类约19～25nt单链非编码RNA分子，可通过完全或不完全特异性碱基配对与靶基因mRNA分子3UTR端相结合，通过促进靶基因mRNA的降解、调控靶基因的翻译以及抑制靶基因的翻译，参与细胞一系列的重要过程，包括细胞分化、增殖与凋亡，从而在生理与疾病过程中起着重要作用。越来越多的研究表明miRNAs在肿瘤组织与癌旁组织的表达具有明显差异。miRNAs表达谱可将肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病与邻近正常组织区分开。更重要的是发现半数以上的miRNAs定位于与肿瘤发生相关的染色体区域和脆性位点，提示miRNAs在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。但是其在肝癌发生发展中的作用研究还处于初级阶段，因此研究与肝癌发生、发展相关的miRNAs表达的变化，探索肝癌发生、发展的分子机制，能够为肝癌的早期诊断和预后预测以及筛选治疗靶点提供有价值的依据。　　本课题初步探讨microRNA-27a（以下简写miR-27）在肝癌发生、发展中的作用。本研究共分两部分:第一部分，我们通过TaqMan探针检测了临床肝癌标本与癌旁组织标本中miR-27a的表达情况;第二部分我们通过生物信息学分析，研究和探讨了miR-27a与其靶蛋白RYBP(RING1 and YY1 binding protein)之间的相互作用，并研究其在HCC发生发展中可能的作用机制。　　第一部分肝癌组织与癌旁组织中miR-27a的表达情况的检测　　[目的]目前已经发现miRNAs在许多肿瘤中失调表达，miRNA与肿瘤的发生密切相关。已有的研究亦表明miR-23a～27a～24在肝癌组织以及与癌旁组织表达中存在差异。本研究拟进一步在肝癌患者中验证miR-27a的表达以及其单独作为肝癌分子标记物的可能性。　　[方法]应用TaqMan(@) MGB探针法定量检测miR-27a在94例HBV阳性癌和癌周组织以及6例血管瘤旁组织中的表达，结合统计学方法，分析其在癌和癌周组织中的表达差异。同时也检测了10种肝细胞株中miR-27a　　[结果] miR-27a在肝癌组织与癌周组织的表达水平显著上调(P＜0.05，paired-samples t test)。利用TaqMan(@) MGB探针法检测miR-27a在10种肝细胞系(9种肿瘤细胞系和一种永生化的肝实质细胞(LO2))中的表达情况。结果证实:miR-27a在大多数肿瘤细胞系中处于高表达，显著高于LO2，但是在高低转移细胞株中没有显著差异。　　[结论]肝癌组织与癌旁组织之间存在miRNA差异表达， miR-27a或许可以成为一个肝癌相关的生物标记物。　　第二部分miR-27a生物学功能探讨　　[目的]已有的研究表明miR-27a在肝癌癌组织与癌旁组织的差异表达，而相应关于RYBP的研究表明其与miR-27a表达是负相关，前期的研究表明miR-27a可能调控RYBP。本部分主要研究miR-27a与RYBP的相互作用以及其在肝癌中的作用。　　[方法]通过瞬时转染pre-miR-27a，建立miR-27a过表达和干扰的稳转细胞株，并研究miR-27a与RYBP之间的相互作用，利用荧光素酶报告基因研究miR-27a与RYBP之间的直接作用。Real-time与Western blot进一步观察了miR-27a在调节RYBP过程中的重要作用。　　结果:采用TargetScan5.1和Pictar网站预测到RYBP为miR-27a的靶基因。荧光定量PCR结果显示，miR-27a在肝癌细胞株中发生不同程度的上调，伴随着RYBP表达量的下调，RYBP是一个Polycomb group(PcG)相关蛋白，在肝肿瘤细胞中miR-27a的表达与RYBP的表达呈负相关。我们在HepG2、MHCC-97H以及MHCC-LM3细胞株中对miR-27a和RYBP的关系进行了更深入的研究。发现转染pre-miR-27a到这三种细胞中以后，上调的miR-27a可以抑制RYBP mRNA和蛋白的表达;而转染miR-27a的抑制序列到这两种细胞中以后，结果显示抑制miR-27a的表达，同时上调RYBP mRNA和蛋白的表达水平。这说明miR-27a可能在转录水平调节RYBP的表达。然后将RYBP基因的3UTR克隆到双荧光素报告基因载体psi-check2的多克隆位点，观察miR-27a的效应，结果表明其miR-27a可以直接作用于RYBP基因的3 UTR起调控作用。　　构建miR-27a慢病毒表达载体，感染细胞，显著提高细胞内miR-27a表达水平，同时抑制RYBP mRNA和蛋白的表达，并增强了细胞的增殖能力;与之相反的是，抑制细胞内miR-27a表达，则促进RYBP mRNA和蛋白的表达，同时抑制了细胞的增殖能力。应用流式细胞仪检测miR-27a对细胞周期的影响，结果发现miR-27a过表达的细胞，G0/G1期的细胞减少，S期的细胞增多。　　[结论]以上结果证实miR-27a通过下调RYBP基因的表达，进而抑制RYBP介导的生长抑制以及改变细胞周期。miR-27a可以促进肝癌细胞的生长。这些结果说明在肝癌中异常表达的miR-27a通过抑制RYBP，进而改变肿瘤细胞的生物学行为如细胞增殖、抗凋亡能力。综上说明miR-27a在HCC的发生、发展中发挥原癌基因的作用。