背景肝癌在我国发病率及死亡率都很高，严重危害人们的健康。因此，研究其发病机理，找出其发生进展过程中的特异性机制，有针对性地寻求预防及早期诊断治疗的契合点，在肝癌防治方面具有重大意义。肿瘤细胞在生长过程中需摄取大量葡萄糖，通过无氧酵解通路合成ATP，其代谢产物用于合成氨基酸和DNA合成所需的核糖，这一效应又称Warburg效应。因此，葡萄糖代谢是维持恶性肿瘤细胞高速生长和转移的主要养料。目前低糖治疗已经做为一种新的肿瘤治疗方式被运用到了临床。但是，在肿瘤细胞内，葡萄糖代谢能否协调激活细胞内其它生物应激反应（如热休克反应、UPR等），以利于肿瘤细胞的高速生长和转移还不清楚。热休克转录因子1（Hsf1）介导的热休克反应在多种肿瘤细胞中呈激活状态。Hsf1通过调控热休克蛋白（如Hsp70、Hsp90、Hsp40、Hsp27和alpha B-crystallin等）或其它未知蛋白的表达而参与调控肿瘤细胞的生长，转移和细胞内稳态。siRNA沉默Hsf1表达可抑制肿瘤细胞的体外生长，敲除小鼠hsf1基因可抑制DEN诱导的小鼠肝癌，Her2诱导的乳腺癌和P53突变诱发的淋巴瘤。因此，Hsf1已被做为新的癌靶蛋白用于肿瘤新药的研制。但是，在肿瘤细胞内调控Hsf1转录活性的机理和信号通路尚不清楚。已报道，在热休克刺激下，Hsf1的转录激活包括Hsf1同源三聚体的形成，hyperphosphorylation，sumoylation和细胞核内转移以及识别，结合特定蛋白基因HSE调控序列等。MAPK、GSK3b、AMPK和mTOR等激酶参与调控Hsf1的激活。AMPK和mTOR是调控蛋白合成，细胞增生和代谢的关键激酶，在肿瘤细胞内，这些激酶的活性受细胞内葡萄糖代谢的调控。另有报道，Hsf1参与胰岛素的信号传导，敲除Hsf1可增加胰岛素受体的表达，降低细胞葡萄糖耐受，并推测hsf1转录活性与葡萄糖代谢有关。根据已报道的资料，我们推测，在生理状态下，肿瘤细胞需摄取大量的葡萄糖来维持其生长所需的能量，葡萄糖代谢参与激活细胞内的热休克反应产生大量热休克蛋白，后者通过其分子伴侣作用调控肿瘤细胞内新生蛋白的正常结构，从而维持快速生长的肿瘤细胞的内稳定――即Hsf1介导的热休克反应受肿瘤细胞葡萄糖代谢的调控。在该课题中，我们应用不同的人肝癌细胞（plc/prf/5、SMMC-7721和相对正常的永生化肝细胞)及小鼠动物模型对葡萄糖调控Hsf1转录活性的作用进行了研究，结果发现，Hsf1的转录活性受葡萄糖代谢的调控，mTOR信号传导通路介导了葡萄糖代谢对Hsf1的转录活化。目的探讨葡萄糖代谢在肝癌细胞内对Hsf1的激活作用及机制。方法1.将永生化肝细胞和肝癌细胞无糖培养24h后，再重新加入30mM葡萄糖继续培养1h、3h、6h、12h，通过Realtime PCR和Western Blotting技术，分别测定重新加入葡萄糖后，不同时间段里Hsf1及其所调控的下游热休克蛋白(Hsp70,Hsp90,Hsp27和alphaB-crystallin)的表达情况。2.用葡萄糖拮抗代谢物2-脱氧-D-葡萄糖代替葡萄糖，阻断葡萄糖代谢，同上方式进行细胞培养，测定Hsf1的激活和下游热休克蛋白的表达。3.通过饥饿饲养C57BL/6J小鼠24h及饥饿后10%葡萄糖水饲养6h，制作动物模型，用Western Blotting技术检测葡萄糖对动物肝脏组织中Hsf1及下游蛋白Hsp70表达的影响。4.将肝癌细胞无糖培养24h后，再重新加入30mM葡萄糖继续培养1h、3h、6h、12h,用Western Blotting技术测定葡萄糖代谢对mTOR及其下游蛋白p70s6K及旁路蛋白AKT的激活情况。5.测定mTOR抑制剂Rapamycin对葡萄糖激活Hsf1通路的抑制作用，进一步证明mTOR参与葡萄糖对Hsf1的激活作用。将细胞无糖培养后，通过Western blotting技术测定在重新加糖并同时使用mTOR信号传导通路抑制剂Rapamycin时，Hsf1是否被激活。6.用Luciferase assay实验检测Hsp70转录启动子分别在无糖、高糖及mTOR信号传导通路被抑制时的启动激活情况。结果1.肝癌细胞plc/prf/5和SMMC7721在无糖培养条件下，磷酸化Hsf1/ser326受到抑制。Hsf1蛋白表达量不变,alpha B-crystallin蛋白表达降低。Hsp70和Hsp90在plc/prf/5细胞中基础表达量高，在无糖培养基中的变化不明显。细胞经无糖饥饿后再在含30mM葡萄糖的培养基中培养，随培养时间的延长，细胞内Hsf1/ser326磷酸化升高，而Hsf1蛋白表达量不变。定量RealTime-PCR结果显示，Hsf1和Hsp70的mRNA表达量在葡萄糖加入细胞培养基6小时后明显高于无糖培养，而加入葡萄糖12小时后，它们升高的量与对照相比，没有明显的改变。在永生化人肝细胞Changliver细胞内，有糖和无糖都不改变Hsf1/ser326磷酸化及Hsf1、Hsp70、Hsp27、alpha B-crystallin的蛋白表达量。2.在plc/prf5和SMMC7721细胞内，应用2-脱氧-D-葡萄糖代替葡萄糖对细胞进行上述处理，结果发现2-脱氧-D-葡萄糖不能诱导Hsf1／ser326磷酸化和Hsf1、Hsp27、Hsp70等蛋白的表达。3.动物学实验，将小鼠在禁食24小时然后再给予含葡萄糖的水6小时，结果发现，给葡萄糖水后，小鼠肝脏中，ps326-Hsf1、Hsf1和Hsp70蛋白明显高于对照小鼠肝脏中的量。4.Western Blotting的结果发现，葡萄糖饥饿肝癌细胞plc/prf/5可抑制mTOR与p70s6K的磷酸化，但不改变AKT/ser473的磷酸化。加入葡萄糖后，mTOR与p70s6K的磷酸化升高，并且能被mTOR抑制剂Rapamycin抑制。而且，Rapamycin可抑制葡萄糖对Hsf1/ser326位点的磷酸化，并降低alpha B-crystallin蛋白的表达量。5.Luciferase assay实验结果显示，高糖培养可激活Hsp70promoter活性。而这种激活作用可被Rapamycin抑制。结论1.在肝癌细胞plc/prf/5和SMMC-721内，Hsf1主要参与调控小分子热休克蛋白的表达如alpha B-crystallin，而对Hsp70和Hsp90的表达调控不明显。2.在肝癌细胞plc/prf/5与SMMC-7721以及正常小鼠肝脏中，葡萄糖通过激活mTOR信号转导通路，磷酸化Hsf1／ser326，进而参与维持Hsf1在肿瘤细胞内的转录活性。3.葡萄糖代谢在肝癌细胞内参与调控Hsf1介导的热休克反应。