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花青素是植物体内重要的次生代谢产物,主要存在于植物花瓣、果实、茎和叶的表皮细胞中。在植物中,花青素能决定花、果实颜色以及抵御环境胁迫,同时,花青素也可吸引昆虫传粉,清除植物细胞产生的自由基等重要生理功能。因此,通过解析花青素生物合成机制,了解植物如何适应环境变化,有利于人类更好地利用植物资源,在生产和实践上具有重要的科学意义和产业前景。本实验室前期进行的研究工作,通过对拟南芥中的JMJC组蛋白脱甲基化酶家族成员IBM1的研究,初步证实了组蛋白甲基化修饰在调控花青素合成中的功能。杨树(Populus trichocarpa)作为木本模式植物,是世界范围内种植最广的速生树木,广泛应用于木本植物重要次级代谢产物的研究。然而,目前对于组蛋白甲基化修饰是否参与木本植物花青素生物合成还没有报道。因此,研究杨树中表观遗传因子参与调控花青素合成的分子机制,可以加深我们对植物花青素合成调节的认识。本研究通过生物信息学分析,在杨树基因组中鉴定到26个JMJC家族蛋白成员。其中有6个与拟南芥IBM1同属JHDM2亚家族,被认为是H3K9特异的组蛋白脱甲基化酶。由于IBM1参与花青素生物合成是通过光信号转导途径的调控,基于此,我们通过对杨树进行光照和黑暗处理,发现PtrJMJ25的表达能够响应黑暗处理;通过构建启动子分析表达载体,进行GUS染色和GUS酶活检测发现,PtrJMJ25的表达水平随着黑暗时间的延长而增加。上述结果表明,PtrJMJ25是一个在黑暗条件下被诱导表达的基因。主要研究结果如下:(1)在拟南芥ibm1突变体中表达PtrJMJ25,可以回复IBM1功能缺失所引起的突变体植株叶片变小、变窄,花粉败育等表型,这表明PtrJMJ25与IBM1在基因功能上具有高度的保守性。(2)通过杨树遗传转化,获得超量表达PtrJMJ25的转基因阳性植株。将植株置于户外光下培养,观察和检测发现花青素在野生型植株叶片中有明显的积累,而在PtrJMJ25超表达植株叶片中基本没有花青素沉积。在分子水平上,在超量表达PtrJMJ25植株叶片中,花青素生物合成的关键酶基因DFR、ANS、UFGT等相比野生型表达量都明显下调,证明PtrJMJ25参与了杨树花青素合成的调控。(3)相比拟南芥中IBM1直接调控光信号转导途径的关键基因SPAs的表达,超量表达PtrJMJ25并未引起杨树中SPAs同源基因表达变化,证明PtrJMJ25不是通过调控SPAs同源基因而影响花青素的生物合成。(4)在PtrJMJ25超表达杨树株系中,杨树特有的花青素抑制因子MYB182的表达被明显上调,并且MYB182的表达也能响应黑暗诱导,提示PtrJMJ25和MYB182在抑制花青素合成中的功能联系。(5)CHIP实验发现,在杨树细胞内,PtrJMJ25可以直接结合MYB182基因的染色质。PtrJMJ25的超量表达导致MYB182基因染色质上H3K9甲基化水平降低,同时引起CHG位点的DNA甲基化水平降低。上述结果证明PtrJMJ25可以通过直接促进MYB182的表达抑制花青素的合成。(6)利用CRISPR-CAS9技术获得内源PtrJMJ25基因敲除的杨树株系。在黑暗条件下,PtrJMJ25敲除植株叶片中花青素的含量和花青素合成酶基因的表达相比野生型均有一定增加,而MYB182的表达水平则显著降低。该结果表明,在野生型杨树中通过PtrJMJ25激活MYB182,是黑暗下关闭花青素合成所必须的。综上所述,杨树中组蛋白脱甲基化酶PtrJMJ25响应环境中光照变化并参与花青素生物合成的表观调控机制:即PtrJMJ25通过直接去除MYB182基因上的组蛋白甲基化修饰,促进MYB182基因的表达,从而在黑暗条件下抑制花青素的生物合成。本研究初步证实了表观遗传修饰在木本植物花青素合成中的功能和机制,进一步加深了对植物花青素的合成如何精确响应环境变化的认识和了解。