胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)来源于囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM),体外建立成为干细胞系,它具有在体外无限增殖和保持未分化状态的自我更新(Self-renewalal)能力,并且具有分化为三胚层中任何细胞种类的潜能。胚胎干细胞可以形成嵌合体并发育分化形成各种成体组织。胚胎干细胞在体外培养和传代过程中,能持续保持快速增殖及多能性状态,且具备定向诱导分化成多种细胞类型的潜力。胚胎干细胞增殖相比普通分化细胞更为迅速,发生基因突变的概率也随之升高,因此维持基因组的完整性尤为重要,为能够迅速去除突变细胞,胚胎干细胞还具备处于凋亡临界点的特性。因此,胚胎干细胞自我更新是一种增殖与凋亡相制衡的机制,可作为理解多能性细胞的发育潜能的关键。p57(Cdkn1c)是细胞周期蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinases inhibitory proteins,CKIs),在细胞周期的G1/S期阶段中,抑制周期蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)与周期蛋白形成复合体,进而抑制Rb磷酸化作用,负调控细胞周期。p57异常表达会引发人类、小鼠的早期胚胎发育生长过程的严重遗传性病变。p57调控小鼠胚胎干细胞自我更新的研究尚少。p57 一方面能广泛调控细胞周期,另一方面能够通过抑制细胞周期进而调控凋亡,p57的异常表达对于凋亡通路的影响与癌症的发生密切相关。本研究主要通过干扰小鼠胚胎干细胞p57表达,检测其对细胞周期进程的影响,以及对凋亡的影响,结合两方面的检测结果,研究p57基因对胚胎干细胞自我更新的影响,初步探索p57对胚胎干细胞多能性基因及相应甲基化修饰的调控。本研究构建了 p57的shRNA干扰载体,转染小鼠ESCs,小鼠ESCs的p57下调。通过对增殖、凋亡及其多能性的检测分析,探究了 p57作为一个细胞周期负调控蛋白,如何影响小鼠ESCs的自我更新及其调控机理。1.ESCs干扰p57后表现出了增殖潜力的提高通过对ESCs克隆进行面积统计,发现干扰p57促进了 ESCs的克隆增大,并进一步通过细胞生长曲线的绘制发现,干扰p57组的ESCs在进入对数生长期之前能够与对照组同步且增殖幅度相近,但是却推迟细胞增殖进入平台期及衰亡期。Edu检测发现干扰p57能够提高ESCs的Edu阳性率,提高增殖能力。研究发现周期蛋白CyclinA,Cyclin E,Cyclin D没有显著变化,周期蛋白激酶Cdk2与对照组细胞表达水平相同,Western Blot检测发现PCNA有显著上调。检测细胞多能性基因发现,Oct4,Zfp42在mRNA水平显著上调。而在蛋白水平上,干扰组ESCs的Klf4显著上调,Ezh2及其调控的H3K27me3显著上调,说明干扰p57能够增强ESCs的增殖和多能性,并且不通过传统的细胞周期调控通路。2.ESC干扰p57后表现出了对凋亡的抑制作用通过TUNEL染色发现干扰p57能够降低ESC的凋亡率,Annexin V/PI检测发现干挽扰组ESCs克隆中PI着色的晚期凋亡细胞相对减少。通过RT-qPCR检测发现,干扰组ESCs的p21显著下调,相反抑调亡蛋白Bcl2显著上调。Western Blot检测发现,干扰组中磷酸化p53表达上调,说明p53活性被抑制。Bax促凋亡蛋白显著下调,而Caspase 3及其Cleaved Caspase3均表达下调。结合上诉结果说明干扰p57后,ESCs细胞多能性增强,进而降低了 ESCs对凋亡的敏感性。