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金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一,国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3～5天才能完成,且灵敏度较低。本研究建立了一套快速检测肉及肉品中金黄色葡萄球菌的PCR方法,以缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间,消除PCR反应抑制因子,提高检测方法的灵敏性。 本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序,其适宜反应体系为:5μL 10×PCR buffer,4μL dNTPs混合物,1μL 20μmol/L正向引物,1μL 20μmol/L反向引物,最适镁离子浓度为1.5mmol/L,0.25μL (5U/μL)Taq,水38.75μL,总反应体系50μL;其适宜PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,94℃预变性4min,再按94℃ 1 min—58℃0.5 min—72℃1.5min进行35个循环,最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序,PCR扩增产物DNA序列与文献报道的靶基因序列的同源性达99.6%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了54株菌,以验证引物的特异性,结果表明:33株金黄色葡萄球菌中33株均为阳性结果;21株其它菌株均为阴性结果。因此该引物特异性强,可用于PCR检测金黄色葡萄球菌。 采用FTA滤膜制备模板进行PCR扩增,其方法的灵敏度为2cfu/20μL反应体系。 对FTA滤膜用于肉中金黄色葡萄球菌PCR直接检测(无需增菌)模板制备的具体方法进行了研究。结果表明:使用FTA滤膜制备模板时,FTA滤膜吸附样品,干燥后采用10%SDS煮沸该滤膜,可消除结合在FTA滤膜上的PCR抑制因子,采用该方法制备的模板可有效的扩增出目的基因。 采用FTA滤膜制备模板,利用PCR技术直接检测(无需增菌)人工污染的肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌,以确定检出限。结果表明:猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉及熟肉制品匀浆液的检出限均为10~1cfu/g。可在6h内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。 比较了PCR检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌的7种DNA模板制备方法,结果表明:FTA滤膜法可高效从样品中提取金黄色葡萄球菌DNA,可有效的消除PCR反应的抑制因子,灵敏度高、操作简便、耗时短,该方法明显优于其他方法。