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石榴(Punica granatum L.)属石榴科石榴属落叶灌木或小乔木,主要分布于陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自和新疆叶城。石榴种质资源的整理和评价是当前一项非常重要的基础工作。石榴各个类型主要根据产地和某些形态特征进行命名,同物异名,同名异物的现象很普遍,为各地石榴种质的交流和科研工作带来很大的不便。分子分类法能从遗传物质DNA水平揭示各个石榴类型之间的亲缘关系,为石榴栽培育种提供理论的依据.花青素作为果实着色的主要成分,是近年来葡萄、苹果、草莓等水果研究的热点之一。研究红花石榴及其白花芽变的机理,既能对育种实践提供理论指导,又具有很高的科学研究意义.本研究首先以21份石榴资源为材料,用RAPD分析了它们之间的亲缘关系；然后又用SRAP分析了23份石榴资源的亲缘关系,对红花石榴的白花变异进行了鉴定；最后又以红花石榴母株为材料,克隆了花青素合成相关基因PgCHS、PgANS、PgUFGT和PgMYB,以及PgActin。对上述基因在红花母株和白花变异株不同发育阶段组织部位的表达差异进行了分析。进一步克隆比较了母株和变异株MYB基因上游调控序列。现将主要研究结果介绍如下:
1、以21个石榴资源为试验材料,利用12条RAPD引物进行PCR扩增,共扩增出1267个条带,其中多态性条带436个,多态率为35％,表明石榴不同类型有丰富的遗传多样性.21个石榴资源遗传距离为0.0909—0.8207。UPGMA聚类结果表明,21个石榴基因型分为5个类群(A、B、C、D和E)。重瓣花和单瓣花石榴基因型存在明显不同的遗传背景.研究发现:来源于枣庄、徐州的大青皮石榴具有不同的基因型。
2、对SRAP-PCR各个影响因素进行了优化。结果表明,石榴叶片适宜的SRAP-PCR反应体系中,含dNTP0.2 mmol/L,Mg2+2 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板0.8 mg/L,Taq酶50000 U/L。采用优化的SRAP-PCR反应体系,对红花石榴母株上的白花变异枝进行鉴定和分析。
3、以23个石榴资源为试材,利用7对SRAP引物进行PCR扩增,共扩增出1380个条带,其中多态性条带662个,多态率为48％。应用DPS分析软件构建UPGMA聚类图,23个石榴资源遗传距离在0.0769～0.4131之间.在遗传距离0.33处,可将石榴资源分为A、B、C、D和E5个类群。4种单瓣白花类型都聚类在A组；B组都是单瓣红花、味甜的鲜食品种；C组中鲜食品种果皮都不着色；4种不同花色或叶型的单瓣、赏食兼用类型则聚在D组；观赏型墨石榴与其它类型显著不同,单独聚为一类(E组)。以上结果表明,石榴资源有着丰富的遗传多样性。
4、用600对SRAP随机引物组合对红花母株和白花芽变DNA进行了分析,其中有580对引物组合有较好的扩增效果,其中Me30/Em7引物组合在母株和变异株间扩增出一条长度为78 bp稳定差异条带。根据该差异片段序列设计的特异引物在母株中有68 bp扩增条带,而在变异株中没有扩增条带,表明白花变异株DNA序列已经发生了改变。
5、用3种不同RNA提取方法对富含多糖和酚类物质石榴果皮RNA提取效果进行了比较。结果表明,改良CTAB法提取的总RNA OD值在1.91左右,得率为48μg/g；Trizol法提取总RNA OD值在1.15左右,得率为86μg、g；试剂盒提取得到的总RNA OD值在1.24左右,得率为124μg/g。分别反转录为cDNA作为RT-PCR模板。根据8种植物花青素合成关键酶基因CHS基因保守序列设计简并引物进行RT-PCR,其中只有改良CTAB法得到的cDNA有扩增条带。而其它2种提取方法得到的cDNAPCR无扩增条带,表明改良CTAB法比较适合石榴果皮总RNA的提取。
6、用简并引物从红花石榴cDNA中扩增出花青素合成相关基因PgCHS、PgANS、PgUFGT、PgMYB,用特异引物扩增出PgActin。其中PgCHS为432bp,Genebank登录号为GU982933；PgANS cDNA片段长618bp,Genebank登录号为GU376749；PgUFGT cDNA片段长1111bp,包括编码区1074bp,3’端非翻译区37bp,Genebank登录号为GU371443；PgMYB cDNA片段长576bp,包括编码区465bp,3’端非翻译区111bp,Genebank登录号为GU371444.Pgactin cDNA片段长168bp,Genebank登录号为GU376750.Blast比对结果表明,上述基因推测氨基酸序列与葡萄、梨等物种有70～80％的序列同源性。以Pgactin为参照基因,分别对红花母株及其白花芽变不同发育阶段幼叶、花萼、花朵进行了半定量表达分析,结果表明PgANS基因在母株和芽变中表达无明显差异；PgVFGT和PgMYB表达差异明显.在母株中PgUFGT、PgMYB有较高的表达量,而在芽变中表达量很低或者检测不到,结果表明PgUFGT和PgMYB在石榴花青素合成中起着重要的调节作用。
7、以PgMYB序列设计引物做Tail PCR,得到MYB5’端上游序列684bp,以此序列和已知cDNA序列分别设计特异引物母株和芽变植株cDNA和DNA中进行PCR扩增,得到PgMYB cDNA全长序列PgMYB,序列为570bp,MYB DNA序列全长930bp及其上游启动子序列543bp,其中MYB DNA全长序列包含有360bp内含子序列,登录号为HM056531。PgMYB cDNA全长序列推测蛋白预测理论分子量为22.25Kda,预测理论等电点为7.15.内含子剪切位点符合‘GT…AG’规则。母株和芽变植株MYB基因序列和上游启动子比对表明,二者完全一致,没有差异。暗示着我们发现的石榴白花突变位点不在于MYB基因及其启动子序列,而在其它调控部位。