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研究目的:探讨内质网应激在腺苷(adenosine)诱导EC109细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法:EC109细胞培养后按以下方法进行实验,(1)四氮唑蓝检测法(MTT):腺苷2 mmol L-1作用于EC109细胞不同时间(24~72 h)及将EC109细胞暴露于不同浓度腺苷(0.5~4 mmol L-1)作用36 h,四氮唑蓝检测法观察腺苷对EC109细胞生存率的时效和量效关系。(2)原位末端转移酶标记技术(TUNEL):不同浓度腺苷(0.5~4 mmol L-1)处理EC109细胞36 h ,原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡情况(3)免疫荧光染色法:细胞贴壁后加入正常培养基(空白组和对照组)或含腺苷2.0 mmol L-1培养基(腺苷处理组)处理细胞36 h,免疫荧光观察腺苷2.0 mmol L-1作用前后内质网应激相关蛋白(GRP78、Caspase-4、Caspase-3、CHOP)的表达及亚细胞定位。(4)免疫印迹法(Western blotting):细胞传代至培养瓶,24 h后分别加入含不同浓度腺苷(0.5~4 mmol L-1)的培养基处理36 h,提取细胞总蛋白质,免疫印迹法检测细胞内质网应激相关蛋白(GRP78、Caspase-4、CHOP)及NF-κB和凋亡执行者Caspase-3分子的表达情况。结果:1、腺苷2 mmol L-1与EC109细胞作用24,36,48和72 h,细胞存活率分别为(57.7 15.0)%,(56.5 11.1)%,(43.8 5.7)%和(28.8 4.1)%,呈时间依赖性下降(r=0.9192,P<0.01)。不同浓度腺苷(0.5,1,2和4 mmol L-1)处理EC109细胞36 h,随药物浓度增加,细胞存活率依次为(83.14 11.2)%,(67.86 6.72)%,(55.31 5.01)%和(45.39 5.45)%,呈剂量依赖性降低(r=0.8252,P<0.01)。2、腺苷0.5~4 mmol L-1处理EC109细胞36 h,细胞凋亡率分别为(15.5 1.1)%,(28.2 0.8)%,(40.1 2.2)%和(50.6 1.3)%,与对照组(2.1 0.3)%相比均明显增加(r =0.874,P<0.05)3、腺苷2 mmol L-1与EC109细胞作用36 h,免疫荧光法检测结果表明,对照组EC109细胞胞浆中出现GRP78的表达,腺苷处理组表达增多;Caspase-4,Caspase-3和CHOP在对照组EC109细胞胞浆中无表达,提示EC109细胞经腺苷处理后Caspase-4,Caspase-3和CHOP蛋白出现表达并发生核移位4、Western blotting结果表明GRP78, Caspase-4, Caspase-3, CHOP和NF-κB表达量呈剂量依赖性增加(rGRP78=0.9471, rCaspase-4=0.8977,rCaspase-3=0.968, rCHOP=0.9762, rNF-κB=0.9471, P<0.05)。结论:1、腺苷能诱导EC109细胞凋亡,与我们既往的对HepG2细胞研究结果一致。2、在腺苷诱导EC109细胞凋亡过程中,内质网应激相关蛋白GRP78、Caspase-4、Caspase-3、CHOP、NF-κΒ的表达明显升高Caspase-4、Caspase-3、CHOP发生明显核易位从胞浆转移进入胞核内,表明内质网应激通路被活化,EC109细胞凋亡与内质网应激途径可能有关。