禽流感病毒免疫组化及RT-PCR斑点杂交检测方法的建立

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将4周龄SPF白来航鸡12羽随机分成试验组和对照组各6羽。感染鸡经滴鼻方式接种H5N1亚型高致病性禽流感病毒尿囊液,对照鸡同样途径接种等量无菌尿囊液。接种40h后试验组鸡全部死亡,将全部鸡剖杀取材。采集组织样品,用4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,进行H.E.和免疫组化染色。临床症状为:感染鸡接种24h后食欲下降,精神高度沉郁。剖检可见肾脏肿大充盈,肠管粘膜中散布有出血点,胰腺出血,法氏囊萎缩,肌腺胃出血。H.E.染色结果显示,病理组织学变化主要表现为肾有淤血,肾小管上皮细胞发生变性和坏死。脾、法氏囊淋、胸腺、盲肠扁桃体中淋巴细胞数目明显减少,坏死。肺淤血,上皮细胞变性、脱落。喉粘膜上皮细胞变性、脱落。肝出血,肝细胞肿胀、变性。肠道和胰腺中有出血、变性、坏死。免疫组化染色显示,在肾、脾、胸腺、盲肠扁桃体、肺和喉等组织内均有阳性细胞从存在,尤在肾和淋巴组织内为多,且病毒主要侵害上皮细胞和淋巴细胞。病毒存在于被感染细胞的胞膜、胞浆和胞核中,同时染色的对照组织均发现到阳性细胞。将4周龄SPF白来航鸡40羽随机分成感染组和对照组各20羽。感染鸡经滴鼻方式接种H9N2亚型低致病性禽流感,对照鸡同样途径接种等量无菌尿囊液。分别于接种后第1、3、7、14、21天随机取感染组和对照组各4羽剖杀。采集组织样品,用4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,进行H.E.染色。临床症状为:接种后第3天,感染蛋鸡精神萎靡,食欲下降,饮水量增加,并有少数鸡的粪便变稀。剖检可见,感染鸡肾脏高度肿胀。肝脏肿大、出血,有浆液性渗出物。肠管粘膜散布有出血点。H.E.染色结果显示:病理组织学变化主要表现肾出血,肾小管上皮细胞发生变性、坏死。肠粘膜上皮细胞变性、坏死,脱落。肺充血。气管粘膜上皮有变性、脱落。肝出血、淤血,肝细胞变性。脾、胸腺、法氏囊淋巴细胞坏死,数目减少。根据GENEBANK中H5N1亚型和H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列,分别设计引物。其中两对引物用于建立RT-PCR方法检测H5和H9亚型禽流感病毒;另外两对引物用于扩增HA基因保守片段,分别用地高辛标记制备成探针。通过探针杂交检测H5和H9亚型禽流感病毒RNA的RT-PCR产物,建立RT-PCR斑点杂交检测方法。结果表明两个亚型的RT-PCR斑点杂交方法比RT-PCR灵敏度高出100到1000倍。
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