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目的 采用细胞培养的方法,从细胞分子水平,探讨左归丸治疗骨质疏松症的机理,以期从成骨细胞与破骨细胞偶联信号传递角度,对“肾主骨”机理进行深入探讨。 方法 1 左归丸含药血清的制备 将15只雌性Wistar大鼠,随机分为3组:正常对照组、卵巢切除(OVX)组、OVX加左归丸组,每组5只。 OVX组与OVX加左归丸组切除双侧卵巢,术后3个月,OVX加左归丸组大鼠灌服左归丸(药液浓度为5.88g/ml,1ml/100g),一日2次,连续5次,末次给药1h后,乙醚麻醉,无菌条件下,经腹主动脉采血,冷置1h,离心(4℃,2500r/min,25min),分离血清,是为含药血清,-20℃冰箱保存备用。OVX组和正常对照组按以上程序,灌服等容积的蒸馏水,所取血清分别为OVX组血清和正常组血清。 2 成骨细胞IL-1、IL-6、COX-2蛋白和m RNA表达的检测 本实验分为3组:成骨细胞(OB)+正常血清组、OB+OVX血清组、OB+OVX含药血清组,每组8个样本。取第3代成骨细胞,经胰酶消化,将细胞悬液以终浓度1×10~4/ml接种到培养皿中(预置多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片),24h后换为含10%各组血清的培养液,培养72h后取出盖玻片,PBS冲洗3次,丙酮固定10min,室温晾干,-20℃保存备用。 采用免疫组化与原位杂交方法,检测IL-1、IL-6、COX-2蛋白和m RNA在成骨细胞内的表达,用Leica图像分析仪进行分析。每个标本随机选取5个视野(光镜下放大×200),测定表达的强度,以灰度值表示。 3 破骨细胞所致骨吸收陷窝数目及面积的检测 本实验分为6组:破骨细胞(OC)+正常血清组、OC+OVX血清组、OC+OVX含药血清组、OB+OC+正常血清组、OB+OC+OVX血清组、OB+OC+OVX含药血清组,每组有8个样本,即每组有8