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炎症性肠病(IBD)是一类在西方国家高发的消化系统炎症的统称,由于对其发病机理尚未有明确的结论,目前主要通过药物维持和手术切除来维持患者处于缓解期。这类疾病本身不会影响患者的生命,但是对其生理和心理产生了痛苦的折磨。本课题利用斑马鱼为模式动物,通过CRISPR/Cas9技术敲除了 pik3c3/vps34基因,获得了致死的斑马鱼突变体。与小鼠同源基因Pik3c3敲除的突变体死于原肠运动不同的是,斑马鱼pik3c3突变体早期发育基本没有异常,但是在8dpf至9dpf时期其小肠组织会产生严重的畸形,并且很快死亡。通过二代测序以及组织学分析,我们得知,pik3c3突变体表现出了炎症性肠病样的特征:(1)小肠上皮组织结构的破坏(小肠褶皱的消失、上皮细胞的脱落、膜蛋白定位异常等);(2)大量的中性粒细胞迁移到了小肠上皮组织;(3)炎症因子(tnfα、illb)和cxcl8a等)表达显著升高。目前,斑马鱼的IBD遗传模型并不多,并且多是由于微生物过度增殖导致。但是通过肠道微生物检测以及无菌培养实验,我们发现pik3c3突变体中的炎症反应并不是由于肠道微生物过度增殖引起的。另外,根据pik3c3已知的功能,我们发现了该突变体的创新之处。首先,Pik3c3的催化产物是磷酸肌醇3-磷酸(PI3P),而在该突变体的小肠上皮组织基本没有PI3P表达。这就证明了 pik3c3缺失导致的小肠表型是通过PI3P介导的。其次,pik3c3缺失导致的炎症反应是上皮细胞自主性的。一方面,通过人为诱导斑马鱼尾鳍损伤,我们发现中性粒细胞可以迁移到损伤部位,并且可以反向迁移离开,这就说明体内中性粒细胞的损伤应答没有受到影响。另一方面,体外3D培养人源结肠上皮细胞Caco2的实验也证明了 PIK3C3的抑制可以破坏上皮细胞的完整性,并且这是通过胞内体运输介导的。第三,pik3c3缺失导致的炎症反应不依赖于细胞自噬和内质网应激。通过TEM以及蛋白表达的检测发现小肠上皮细胞自噬并没有受到明显抑制。这就排除了细胞自噬以及内质网应激在该突变体中导致炎症应答的影响。此外,pik3c3突变体还有极大的应用意义。大量IBD患者的GWAS筛选发现了许多与上皮细胞屏障作用相关的基因(cdh1、hnf4a、ttc7a等),我们发现在该突变体的上皮细胞中这些基因表达显著下调。同时,我们发现tnfa并没有在小肠组织中明显激活,这也就解释了为什么TNFα抑制剂对某些患者没有作用。因此,该突变体在IBD药物的筛选方面也具有很大的价值。综上所述,pik3c3突变体不仅解释了该基因在上皮细胞稳态维持方面的作用,还建立了上皮细胞损伤IBD模型,在IBD机理研究和临床治疗方面都有光明的前景。