1956年Faber在研究大鼠癌变机制时首先提出了卵圆细胞的概念,1958年Wilson和Leduc在研究小鼠营养性肝损伤的修复机制中发现,增殖的毛细胆管细胞(终末胆管细胞)具有干细胞样特性,可分化为肝细胞和胆管细胞,于是首次提出肝内可能存在具有双向或多向分化潜能的肝干细胞,自此许多研究相继证实成年哺乳动物肝脏存在卵圆细胞。正常成年肝脏处于相对静止状态,分裂相很少,分裂指数为1/2万～1/4万,正常情况下位于小叶间胆管及Hering管的胆管上皮细胞处于休眠状态,严重肝损伤伴功能紊乱如大部分肝细胞坏死和/或摄入大量肝毒性物质,使这些细胞活化移出并分化成熟为肝细胞和胆管上皮细胞,这些细胞即所谓卵圆细胞。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一个CXC趋化因子家族成员,在胚胎的发生过程中发挥重要作用,CXCR4是SDF-1的特异性受体,仪能与一种配体即SDF-1结合。在成人,CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中,包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺、及脾脏等,CXCR4在胚胎发生过程中同样也发挥了非常重要的作用。研究表明,在肝卵圆细胞增殖过程中SDF-1可能通过自分泌/旁分泌途径刺激卵圆细胞的增殖。 本研究在建立大鼠肝卵圆细胞活化增殖模型的基础上,应用CXCR4的特异性抑制剂AMD3100封闭CXCR4,从而阻断SDF-1/CXCR4生物学轴的作用,探讨SDF-1/CXCR4轴在卵圆细胞增殖过程中的作用及意义。探索研究卵圆细胞增殖的调控机制,在为细胞移植和生物人工肝提供一种新的细胞来源,治疗各种原因所致的急性和亚急性肝细胞坏死性疾病以及体外基因治疗等方面具有重要意义。 材料与方法： 1.材料：雄性Wistar大鼠144只,体质量为180～200g,购自中山大学医学院动物实验中心。AAF、AMD3100和分子量为400的聚乙二醇为美国Sigma公司产品；单克隆抗体：小鼠抗大鼠细胞角蛋白CK18抗体,小鼠抗大鼠细胞角蛋白CK19抗体均为美国Sigma公司产品,小鼠抗大鼠甲胎蛋白(AFP)抗体购自Biogenesis公司。小鼠抗大鼠SDF-1抗体购自博莱生物实验材料研究所。小鼠抗大鼠CXCR4抗体购自香港先进技术工业有限公司。 2.实验分组及处理：144只大鼠平均分为4组:AAF组,AMD3100组,AAF/AMD3100组和PH组。动物购来后,普通饲养1周,AAF组大鼠通过胃管灌喂AAF,同时通过尾静脉注射生理盐水,每日1次,连续4 d,第5 d在2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.1mg/100g)下行2/3肝切除术,手术当日不灌喂、也不注射,第6 d继续灌喂并注射。AMD3100组大鼠通过胃管灌喂生理盐水,同时通过尾静脉注射AMD3100,余同AAF组。AAF/AMD3100组大鼠通过胃管灌喂AAF,同时经尾静脉注射AMD3100,余同AAF组。PH组大鼠通过胃管灌喂生理盐水,同时通过尾静脉注射生理盐水,余同AAF组。AAF溶于分子量为400的聚乙二醇,给予剂量均为15mg/(kg.d),AMD3100溶于PBS溶液,给予剂量均为1.25mg/(kg.d)。各组灌喂生理盐水的量与灌喂的AAF溶液量相同,经尾静脉注射生理盐水的量与注射的AMD3100量相同。各组分别于手术后第3、5、7、10、14、21 d处死大鼠(每组6只),留取大鼠肝脏组织以10％的甲醛溶液固定,常规石蜡包埋切片,以备行HE染色及免疫组化染色。 3.组织学检查石蜡切片经脱蜡水化后,用HE染色,显微镜下观察肝组织结构变化、卵圆细胞的形态及数量。 4.免疫组织化学染色连续石蜡切片经脱蜡至水后,以3％的过氧化氢溶液浸泡10 min灭活内源性过氧化物酶；抗原热修复后以正常山羊血清封闭,然后加第一抗体工作液4℃过夜；加生物素标记的第二抗体37℃ 30 min;加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB),显微镜下观察5～10 min,棕黄色染色为阳性信号；以PBS代替第一抗体作为阴性对照。 5.结果判断标准组织学检查：阳性细胞为胞浆和(或)胞膜棕褐色染色。计算出400倍镜下,随机10个视野平均阳性细胞,与1.6相乘后所得为细胞数/mm2。大鼠肝卵圆细胞增殖的定量比较：各时点标本共选取10个互不重叠且肝卵圆细胞增殖最明显的视野,400×显微镜下对符合肝卵圆细胞特征且CK19染色呈阳性的细胞进行计数,然后取其平均数值作为该标木肝卵圆细胞增殖数量。 6.统计学处理所有数据用均数±标准差(-x±s)表示,采用SPSS11.0软件分析,多组资料均数比较用F检验。两组资料之间的比较用LSD-t检验,以P=0.05为统计学判断标准。 结果： 1.肝组织学检查结果AAF组大鼠术后第14 d可见少数胆管增生反应,术后第21 d见明显的胆管增生反应。AAF/AMD3100组大鼠术后第14 d肝组织内血管明显扩张,肝细胞核增大,肝窦及门管区有较多淋巴细胞浸润,术后第21 d肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,部分肝细胞呈大片状坏死。AMD3100组和PH组大鼠为正常肝脏组织结构。 2.卵圆细胞增殖情况AAF组大鼠肝组织内均见有肝卵圆细胞增殖反应,术后第3 d卵圆细胞数量较少,零散分布于门管区,从术后第7 d起,卵圆细胞的数量开始增多,增殖高峰期为术后第10～14 d,术后第21 d开始减少。术后第14 d卵圆细胞的数量多,细胞核清晰,部分核仁可见,但核仁小,有卵圆细胞向胆管样细胞分化的迹象,术后第21 d卵圆细胞数量少,体积较术后第14 d明显变大,核仁小而明显,卵圆细胞向胆管样细胞明显分化。AAF/AMD3100组大鼠肝脏组织内卵圆细胞的数量在术后第3 d与AAF组无差别(6.40±2.22对6.20±1.93,t=0.215,P>0.05),术后第5、7、10、14、21 d均与AAF组差异显著,尤以术后第14 d最为明显(27.50±2.92对1.60±1.17,t=26.06,P<0.05),并且随着注射AMD3100时间的延长,卵圆细胞的数量逐日减少。AMD3100组和PH组大鼠肝脏组织内均未见肝卵圆细胞。增殖的肝卵圆细胞大多以门管区为中心,沿着肝窦呈簇状或放射状分布,肝卵圆细胞呈圆形或卵圆形,胞浆较少,细胞核较小,比肝细胞核约小1/3。 3.免疫组化染色结果AAF组大鼠术后第3、5、7、10、14、21 d肝卵圆细胞胞浆CK18、CK19、AFP、SDF-1及其受体CXCR4染色均呈阳性信号；术后第14 d SDF-1阳性细胞沿着汇管区胆管上皮生长,小叶内肝细胞呈现迟发性SDF-1阳性表达,CXCR4阳性细胞沿胆管样细胞成簇状分布；术后第21 d卵圆细胞向胆管样细胞分化:CK18、CK19和AFP阳性细胞数均自术后第7d开始增多,术后10～14d达高峰,随后开始减少。AAF/AMD3100组大鼠术后第3天卵圆细胞胞浆SDF-1及其受体CXCR4染色阳性,且随着注射AMD3100时间的延长,SDF-1及CXCR4阳性细胞的数量明显减少(P<0.01)。AMD3100组和PH组大鼠肝脏组织内均未见SDF-1及CXCR4阳性表达信号。 结论:SDF-1/CXCR4生物学轴可能有刺激肝卵圆细胞的增殖作用。