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肝素酶(heparinase,Hpa)是一类作用于肝素(heparin)或者硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)分子的多糖裂解酶,它能特异性的断裂肝素链上具有特定修饰的不同序列,从而产生不同的寡糖片段。肝素酶在动物组织细胞中广泛存在外,在各类细菌,类菌体中也有存在。自从在肝素黄杆菌中发现肝素酶以来,人们对肝素酶以及肝素酶生产菌做了大量的研究,肝素酶最重要的用途是制备低分子量肝素,此外在体外血液循环中肝素的消除、肝素精确结构的确定、肝素抗凝机理和肝素结构与功能研究、产科领域的应用等方面都具有重要作用。近年来,研究又发现,肝素酶参与肿瘤血管生成,与肿瘤的侵袭转移密切相关,因此又逐渐成为引人注目的抗肿瘤治疗新靶点。但是,目前商品化的肝素酶都来源于肝素黄杆菌,价格非常昂贵,不能被普通老百姓接受,因此致力于新的肝素酶产生菌的研究意义非凡。目前,关于肝素酶的表达研究,大部分在大肠杆菌中。由于表达产生包涵体,复性后收率降低,而且不易分离纯化,限制了肝素酶的广泛应用。而巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的优秀的真核表达系统,研究报道已有很多外源基因成功表达。本研究主要是利用巴斯德毕赤酵母构建高效分泌表达肝素酶的基因工程菌,并通过响应面优化、5 L发酵罐扩大培养等提高肝素酶的产量。具体研究结果如下所述:从肝素黄杆菌全基因组中扩增出编码肝素酶Hpa I的cDNA基因,并将其连接到表达载体pPIC9K上,形成重组质粒pPIC9K-HpaI。经限制性内切酶BamH I线性化后,电击转化毕赤酵母原始菌株GS115中。通过不同浓度的G418抗压筛选高拷贝转化子,辅助天青A测酶活法获得一株高产肝素酶I的基因工程菌株命名为2号酵母重组子,肝素酶酶活为210.26 U/L,通过SDS-PAGE分析证明肝素酶蛋白大小约为43 kDa。从摇瓶水平探索甲醇诱导时间、甲醇浓度、装液量、油酸、PTM1、Tween-80和诱导前菌体浓度七方面对2号酵母重组子表达肝素酶的影响,在此基础上进行2-level Factorial实验,分析结果确定了油酸、装液量和甲醇为最关键因子。再利用Box-Behnken实验设计,确定2号酵母重组子表达肝素酶的最佳诱导培养基是:1.00%酵母膏,2.00%蛋白胨,1.34%YNB,100 mM磷酸盐缓冲液,0.96%甲醇,0.071%油酸,0.04%PTM1,4.00×10-5%生物素,0.5%Tween-80,最佳诱导条件为:接种量7%,装液量34.3mL/250 mL,菌液OD600=7时开始添加甲醇诱导,诱导96 h后肝素酶产量达到最大值322.95 U/L,是未优化前的1.6倍。实验测得的蛋白质含量为1.03 g/L。最后利用5 L小型发酵罐对重组酵母进行高密度培养的初步研究,基本确定发酵培养分为4个阶段:菌体生物量积累、甘油流加、碳源饥饿以及诱导表达。实验结果显示在诱导110 h时肝素酶活性达到最高值398.5 U/L,仅比96h的酶活性394.5 U/L提高了 4U/L,同样蛋白质最高含量1.29g/L仅比96h的含量1.27g/L提高了 0.02g/L,所以综合经济成本考虑认为96 h是最合适的诱导时间。此研究内容为进一步工业化扩大培养奠定了良好的基础。