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背景本文研究内容属于重庆华森制药有限公司委托项目。该制剂为上市中成药(国药准字：Z20055185),具有活血通络、祛风散寒之功效,主治头痛属风寒瘀血阻滞脉络症者。但该药缺乏药效成分含量控制标准,主治头痛的范围缺乏现代疾病的限定范围,缺乏治疗偏头痛的效果验证及其作用机制阐释。委托单位拟进行该制剂治疗偏头痛的药效及其提取物的量效关系研究。该课题所属项目“中药大品种都梁软胶囊技术改造”获得科技部“重大新药创制”专项(2010ZX09401-306-3-4)资助。目的研究都梁软胶囊提取物改善偏头痛模型大鼠的量-效关系,并在最佳用药剂量基础上,观察都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠的治疗效果,并对其机制进行探讨,为临床用药提供现代药理学实验依据和作用机制阐释。方法1.都梁软胶囊主要成分的含量检测：采用高效液相色谱仪对都梁软胶囊主要成分进行含量检测。其中,欧前胡素和异欧前胡素：色谱柱(ODS C18柱),流动相(乙腈：水=52：48),流速(1mL·min-1),柱温(30℃),检测波长(248nm)；阿魏酸：色谱柱(ODS C18柱),流动相(甲醇：0.1%磷酸=35：65),流速(1mL·min-1),柱温(30℃),检测波长(321nm)。2.都梁软胶囊提取物治疗偏头痛模型大鼠的量-效关系研究：SD雄性大鼠90只,180～220g,随机分成9组,即正常组、模型组、舒马普坦组、都梁软胶囊提取物6个不同剂量(0.13g·kg-1、0.39g·kg-1.1.31g·kg-1、3.93g·kg-1、13.13g·kg-1、39.39g·kg-1)组,每组10只。连续灌胃给药7天(给药量为10mL.kg-1),正常组和模型组给予等体积的溶媒。第7天给药30min后,除正常组外,各组皮下注射硝酸甘油10mg-kg-1造模,模型组给予等体积的生理盐水。随后以30min为一个观察时间段,对大鼠造模后0～180min进行行为学观察,记录相关症状结果。造模4h后,麻醉,取血,分离血清和血浆,放免法测定血浆降钙素基因相关肽(CGRP)和内皮素(ET)含量,酶免法测定血清一氧化氮(NO)含量。取血后迅速取脑,分离脑干,称重,荧光分光光度法测定脑干内5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量。3.都梁软胶囊改善偏头痛模型大鼠行为学指标观察：SD雄性大鼠60只,180-220g,随机分成6组,即正常组、模型组、舒马普坦组、都梁软胶囊低、中、高剂量(0.44g·kg-1、1.31g·kg-1、3.93g·kg-1)组,每组10只。连续灌胃给药7天(给药量为10mL·kg-1),正常组和模型组给予等体积的溶媒。第7天给药30min后,除正常组外,各组皮下注射硝酸甘油10mg·kg-1造模,模型组给予等体积的生理盐水。随后以30min为一个观察时间段,对大鼠造模后0～180min进行行为学观察,记录相关症状结果。4.都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠血液生化指标及脑干单胺类递质的影响：SD雄性大鼠60只,180～220g,随机分成6组,即正常组、模型组、舒马普坦组、都梁软胶囊低、中、高剂量(0.44g·kg-1,1.31g·kg-1,3.93g·kg1)组,每组10只。连续灌胃给药7天(给药量为10mL·kg-1),正常组和模型组给予等体积的溶媒。第7天给药30min后,除正常组外,各组皮下注射硝酸甘油10mg·kg-1造模,模型组给予等体积的生理盐水。造模4h后,麻醉,取血,分离血清和血浆,放免法测血浆CGRP、 ET,紫外分光光度法测血清NO含量。取血后迅速取脑,分离脑干,称重,荧光分光光度法测定脑干内5-HT、 NE、 DA含量。5.都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠炎症相关因子的影响：SD雄性大鼠60只,180～220g,随机分成6组,即正常组、模型组、舒马普坦组、都梁软胶囊低、中、高剂量(0.44g·kg-1、1.31g·kg-1、3.93g·kg-1)组,每组10只。连续灌胃给药7天(给药量为10mL·kg-1),正常组和模型组给予等体积的溶媒。第7天给药30mmin后,除正常组外,各组皮下注射硝酸甘油10mg·kg-1造模,模型组给予等体积的生理盐水。造模4h麻醉处死实验动物,在冰上分离脑干,在4-C预冷的缓冲液中冲冼,并将组织分离成小块,严格按照RIPA裂解液(强)和细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书操作,提取脑干组织总蛋白和胞核蛋白,BCA法测胞浆蛋白和核蛋白的含量。Western Blot法测定脑干胞核中核因子-kappaB p65(NF-κB p65).细胞癌基因fos(c-fos)蛋白的表达,及总蛋白中一氧化氮合成酶(iNOS).白介素-1β(IL-1β)、环氧合酶-2(COX-2)的表达。结果1.都梁软胶囊主要成分的含量检测：欧前胡素含量为1.54mg.g-1,异欧前胡素含量为0.49mg·g1,阿魏酸含量为51.46μg.g-1。2.都梁软胶囊提取物治疗偏头痛模型大鼠的量-效关系研究：在行为学方面,与正常组比较,模型组大鼠在整个观察时间段(0～180min)挠头、爬笼次数显著性升高(P<0.01),并出现耳红症状；与模型组比较,都梁软胶囊提取物0.13g.kg-1、0.39g·kg-1、1.31g·kg-1、3.93g·kg-1、13.13g·kg-1、39.39g·kg-1组大鼠在造模0-60min后挠头、爬笼次数无下降趋势,两者比较无显著性差异(P>0.05);1.31g·kg-1、3.93g·kg-1、13.13g·kg-1、39.39g·kg-1组大鼠在造模90～180min后挠头、爬笼次数显著性降低(P<0.05或P<0.01),且耳红和爬笼消失时间显著缩短(P<0.01)。在对血液及脑干生化指标影响方面,与正常组比较,模型组血浆CGRP和血清NO显著性升高,血浆ET和脑干5-HT、NE、DA含量均显著性降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较,都梁软胶囊提取物1.31g·kg-1、3.93g·kg-1、13.13g·kg-1、39.39g.kg-1组血浆CGRP和血清NO含量显著降低(P<0.05或P<0.01),3.93g·kg-1、13.13g·kg-1、39.39g·kg-1组血浆ET含量显著升高(P<0.01),1.31、3,93、13.13、39.39g·kg-1组脑干5-HT、NE含量显著升高(P<0.05或P<0.01),39.39g·kg-1组脑干DA含量显著升高(P<0.05)。所有评价指标在1.31～39.39g.kg-1范围内存在一定的量效关系。3.都梁软胶囊改善偏头痛模型大鼠行为学指标观察：与正常组比较,模型组大鼠在整个观察时间段(0～180min)挠头、爬笼次数显著性升高(P<0.01),并出现耳红症状,显示模型成功。与模型组比较,都梁软胶囊0.44g-kg-1、1.31g-kg-1、3.93g·kg-1组大鼠在造模0-60min后挠头、爬笼次数无下降趋势,两者比较无显著性差异(P>0.05)；1.31g·kg-1、3.93g·k-1组大鼠在造模60～180min后挠头、爬笼次数显著性降低(P<0.05或P<0.01),且耳红和爬笼消失时间显著缩短(P<0.01)。提示都梁软胶囊在1.31g·kg-1至3.93g-kg-1剂量范围内,给药7天,能显著改善造模60～180min偏头痛模型大鼠行为学异常。4.都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠血液生化指标及脑干单胺类递质的影响：与正常组比较,模型组血浆CGRP和血清NO显著性升高(P<0.01),血浆ET及脑干5-HT、NE和DA含量均显著性降低(P<0.01)。与模型组比较,都梁软胶囊0.44g·kg-1组脑干5-HT、NE、DA含量显著升高(P<0.01)；1.31g·kg-1组血浆CGRP和血清NO含量显著降低(P<0.01),脑干5-HT、NE、DA含量显著升高(P<0.01)；3.93g·kg-1组血浆CGRP和血清NO含量显著降低(P<0.01),血浆ET、脑干5-HT、NE、DA含量显著升高(P<0.01)。提示都梁软胶囊在0.44g·kg-1至3.93g·kg-1剂量范围内,给药7天,能显著改善偏头痛模型大鼠血液生化指标及脑干单胺类递质异常。5.都梁软胶囊对偏头痛模型大鼠的炎症相关因子的影响：与正常组比较,模型组大鼠脑干胞核内NF-κB p65、 c-fos及总蛋白内iNOS、 COX-2、IL-1βp的表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,都梁软胶囊1.31g·kg-1、3.93g·kg-1组大鼠脑干胞核内NF-κB p65、 c-fos及总蛋白内iNOS、 COX-2、 IL-1β的表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。提示都梁软胶囊在1.31g-kg-1至3.93g·kg-1剂量范围内,给药7天,能显著改善偏头痛模型大鼠炎症相关因子异常。结论1.建立了都梁软胶囊主要成分的检测方法,提高其质量控制标准。2.成功复制了硝酸甘油致偏头痛大鼠模型,并运用于都梁软胶囊相关研究中。3.在对都梁软胶囊提取物治疗偏头痛的量-效关系研究中,都梁软胶囊提取物0.13g·kg-1.0.39g·kg-1组均只有改善相关指标的作用趋势,但无显著性差异。其剂量在1.31g·kg-1-39.39g·kg1范围内有明显改善相关指标的作用,且呈现出一定的量效关系。其中,39.39g·kg-1组对部分指标的改善较13.13g·kg-1组反而降低。4.都梁软胶囊在1.31g.kg"1至3.93g·kg-1。剂量范围内,给药7天,能显著改善造模60～180min偏头痛模型大鼠行为学异常,改善血液生化指标及脑干单胺类递质异常,以及改善炎症相关因子异常。5.都梁软胶囊可显著改善偏头痛模型大鼠的血液和脑组织中,血管舒缩功能和神经痛觉增敏相关指标的异常变化,这可能是其治疗偏头痛的重要作用机制之一。6.在硝酸甘油致偏头痛模型大鼠的脑干组织中,NF-κB通路介导的相关炎症因子被激活,这证明了硝酸甘油致偏头痛有可能是由于其引起了脑干的无菌性炎症。而都梁软胶囊能明显降低这些炎症因子的表达,这也可能是其治疗偏头痛的重要机制之一。