骨质疏松症是一个复杂的高遗传力疾病,已经成为威胁人类公共健康的主要问题,但是它的遗传发病机制还不十分清楚、有效的治疗方法还有待深入研发。高繁殖力和高泌乳力的奶牛和母猪、高产蛋量的笼养蛋鸡中出现不同程度的骨质疏松是畜禽因高产引起的骨矿物质流失的现象,人类主要通过改变饲料配方来预防其对农业生产的危害却并不能从根本上解决问题,因此从遗传的角度,揭示骨矿物质流失的发病机制,培育出可以抵抗因高繁殖和高生产而导致骨矿物质过度流失的新品种,将是遗传工作者的重要任务之一。因此以小鼠为动物模型,探索骨质疏松症的转录调控机制,将为骨质疏松症发病机制的研究和药物的开发提供理论基础和研究素材。本文首先通过体外试验证实,通过阻断MTs的组装,可以有效刺激成骨细胞的分化,增强成骨细胞矿化能力；然后,通过基因敲除小鼠模型,进而揭示STMN1可以内源性的抑制MTs组装,影响小鼠的骨骼发育,并初步揭示STMN1-Gli2-BMP2信号通路的调控机制。1.鉴定STMN1基因缺失小鼠出生后的骨骼表型的变化。对1月龄和3月龄STMN1基因缺失小鼠的双能X射线吸收仪(DEXA)骨密度(BMD)进行分析,STMN1基因缺失小鼠的骨密度随着年龄递增呈现出骨流失加重的现象。利用Micro-CT技术进一步分析小鼠骨微结构变化,与同窝同龄的野生小鼠比较,3月龄小鼠骨小梁BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁的体积、以及骨实质BMD都显著降低(p<0.05)。该结果提示STMN1在小鼠骨骼的的正常维持中起重要的调控作用。2.利用组织形态学技术,分析缺失STMN1基因小鼠的骨骼的形态学。利用H&E染色(偏重成骨细胞分析)、Trap染色(偏重破骨细胞分析)、Von Kossa染色(骨沉积分析)、Alazrin Red S染色(骨沉积分析)等技术对组织形态学进行分析,STMN1缺失以后,成骨细胞数量减少、破骨细胞数量增多、骨骼沉积能力降低。进一步说明,STMN1在小鼠体内可能具有调控成骨细胞和破骨细胞的功能。3.细胞水平上,探讨STMN1与MTs的调控机制。首先,在体外小鼠成骨细胞MC3T3-E1和破骨细胞前体细胞Raw264.7细胞中超表达STMN1；与此同时,分离STMN1缺失的原代颅骨成骨样细胞进行培养,通过免疫荧光分析STMN1上调／下调后对MTs的组装、解离的调控作用,发现STMN1缺失可以使成骨细胞、破骨细胞中MTs组装作用加强,反之亦然。推测STMN1在成骨细胞和破骨细胞中,通过改变MTs的动态结构来调控下游基因的表达。4.在转录水平上,鉴定STMN1对下游成骨/破骨细胞中的基因具有调控作用。通过基因调控技术,上调/下调STMN1后,分别选取成骨细胞标志因子BMP2、Runx2、Collal、Osteocalcin,及破骨细胞标志因子RANK、RANKL、ATP6、CathepsinK等基因,进行转录水平的研究。研究发现,STMN1缺失以后在转录水平上抑制成骨细胞、促进破骨细胞分化成熟,反之亦然。5.生物信息学分析、启动子荧光素酶实验的研究表明,STMN1缺失以后,MTs装配能力增强,进而抑制Gli2蛋白水解作用,激活转录因子G1i2,从而转录激活下游骨形成蛋白BMP2的蛋白表达作用。因此在骨骼的正常维持中提出"STMN1-Gli2-BMP2"信号调节通路作用机制的假设。总之,本论文首次从小鼠整体的角度研究STMN1对骨骼的影响,发现STMN1通过调节微观蛋白的结构变化,激活、抑制转录因子的活性,从而影响下游成骨细胞、破骨细胞中靶基因的表达,初步揭示了STMN1在骨骼发育中的表达调控模式。这为深入探索骨质疏松症、奶牛等产后瘫痪的致病机理、新药筛选等奠定了一定的理论基础。