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家兔呼吸道传染病发病率高，波及范围广，造成的经济损失大，尤以兔肺炎克雷伯氏菌病（Klebsiella pneumonia disease，KPD）、兔瘟(兔出血症、Rabbithemorrhagic disease，RHD)、兔多杀性巴氏杆菌病(Pasteurellosis)和兔支气管败血波氏杆菌病(Bordetellosis)发病率高，危害大。由于它们具有相似的临床表现与病理变化，给准确诊断带来了困难。为了能及时、准确、快速诊断家兔这4种具有相似病变的疾病，本实验建立了一种能够同时检测这4种病原的MPCR方法。 根据GenBank中的肺炎克雷伯菌（KP.）的16S rRNA V2可变区基因、兔瘟病毒(RHDV)的VP60基因、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的ktm1基因和支气管败血波氏杆菌（B.bronchiseptica）的ptxA基因，设计4对引物，序列分别为 P1: AGCACAGAGAGCTTG; P2: ACTTTGGTCTTGCGAC; P3:TCGCTCAACAACTACTCG;P4: TAGTTGCAGCTCTTGCCT;P5:ATCCGCTATTTACCCAGTGG;P6:GCTGTAAACGAACTCGCCAC; P7:GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG; P8: ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG,分别扩增长度为127bp、322bp、457bp和872bp的特异性片段。对影响MPCR反应的六大因素（包括退火温度、引物浓度、dNTP Mixture浓度、Mg2+浓度、rTaq添加量和循环次数）进行优化，建立了MPCR检测方法，优化后25μL体系为10×PCR Buffer(Mg2+ Free)2.5μL; dNTP Mixture(2.5mM each)0.5μL; Mg2+(25mM)1.5μL; Primer Mix(12.5mM each)4.0μL; Template DNA/cDNA of Sample4.0μL;rTaq(5U/μL)0.5μL; ddH2O12.0μL。反应参数为95℃5min;94℃50s，56.8℃40s，72℃1min，30个循环;72℃10min;4℃保存。MPCR产物按5比1混合6×loading Buffer经2％琼脂糖凝胶电泳检测。 特异性试验发现，该方法仅与相对应模板发生特异性扩增，而与兔源金黄色葡萄球菌、兔源无乳链球菌、兔源粪肠球菌、兔魏氏梭菌及蒸馏水空白对照未发生扩增反应。该MPCR方法对于4种病原的检测灵敏度分别可达9.16×10-3 ug/ml、7.24×10-6 ug/ml、7.96×10-3ug/ml和6.8×10-4 ug/ml。对于人工感染病例的检测，检测结果表明该方法能够很好的检测出相应的单一或混合病原。同时检测兔肺炎克雷伯氏菌病、兔瘟、兔多杀性巴氏杆菌病和兔支气管败血波氏杆菌病耗时约5小时，其灵敏度、特异性、稳定性和高效性远优于传统的细菌分离培养检测方法，可运用于临床诊断。