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长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是一类转录本长度大于200nt、不具有蛋白编码功能的RNA分子。它在表观遗传学、转录及转录后等多种水平以RNA形式调控基因表达,参与机体的病理生理过程。LncRNA还能与靶蛋白、微小RNA分子(microRNA,miRNA)构成调控网络,参与肿瘤进程。近年来多项研究发现LncRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)中,LncRNA正逐步成为肝癌诊治研究的新热点。人肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一种肿瘤相关的LncRNA,2003年在肺癌中被发现过表达,并参与肺癌转移与癌症进程。随后有研究发现MALAT1可参与多种肿瘤的形,且在肝癌中过表达,与AFP高水平、肿瘤数目多以及肝移植术后癌症易复发相关。目前研究已知MALAT1可通过调节丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor1,SRSF1)的招募和磷酸化,影响 SRSF1对肿瘤相关基因mRNA的剪接,并通过调节基因表达、信号通路参与肿瘤形成,但其过表达机制尚不明确。特异性蛋白(Specificity protein,Sp)家族是一类核转录因子,其中Sp1和Sp3在分子结构、结合位点、组织分布上均具有极大相似性。在肝癌中,Sp1可调节VEGF以及Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin的转录。本课题组前期研究发现在肝癌中,Sp3具有与Sp1类似作用。Sp3的高表达与肿瘤直径大、分化程度差相关。且Sp3参与VEGF和β-catenin表达,对β-catenin基因具有明显转录激活作用。ChIPBase数据库收录543个ChIP-Seq芯片结果,首次提出转录因子对非编码RNA(Noncoding RNA,NcRNA)可能的转录调控网络。数据库结果显示正常肝组织中,Sp1与MALAT1启动子区域之间存在多个可能结合位点。但肝癌中Sp1是否也能通过类似结合位点调节MALAT1的转录,以及与Sp1极具相似性的Sp3是否也参与其中,均有待进一步实验验证。第一部分转录因子Sp1/3和MALAT1在肝癌中的表达及联系目的:检测肝癌癌组织和三株癌细胞中Sp1、Sp3以及MALAT1的表达,分别分析三者与临床病理资料的关系,并初步确定肝癌中MALAT1的表达与Sp1和Sp3 mRNA水平的关系。方法:采用qRT-PCR检测32例肝癌癌组织和相应癌旁组织中Sp1、Sp3和MALAT1的mRNA表达,分析三种基因mRNA水平与相应临床病理资料的联系。qRT-PCR和Western Blot(WB)测定三株肝癌细胞株Bel-7402、Huh7及HepG2中Sp1、Sp3和MALAT1的表达水平。RNA干扰技术下调三株肝癌细胞株中Sp1和Sp3的表达,qRT-PCR分别检测单独沉默Sp1(iSp1)、单独沉默Sp3(iSp3)、联合沉默Sp1与Sp3(iSp1/3)后,细胞株中MALAT1表达的变化。用MTT法测定Sp1抑制剂光神霉素(Mithramycin A,MIT)在 HepG2 细胞株中用药 96h 的 IC50,以 IC50 浓度作用HepG2细胞72h后,检测Sp1、Sp3和MALAT1 mRNA在药物作用下表达的变化。结果:Sp1、Sp3和MALAT1 mRNA水平在癌组织中表达均明显高于相应癌旁组织,且Sp1和MALAT1mRNA水平与血清AFP含量相关(Sp1:r=7.44,P=0.0064;MALAT1:r=12.37,P=0.0004)。三株肝癌细胞株均较正常肝上皮细胞株L-02出现Sp1、Sp3和MALAT1的明显高表达。单独沉默Sp1或Sp3后,MALAT1表达均无明显变化,而联合沉默后MALAT1均出现表达下调(P<0.05)。MIT用药72h后,Sp1、Sp3和MALAT1表达均出现明显下调(P<0.05)。结论:Sp1、Sp3和MALAT1的高表达参与肝癌形成。Sp1、Sp3与MALAT1表达间可能存在密切联系。药物MIT可有效抑制MALAT1在HepG2细胞的表达。第二部分转录因子Sp1/3对MALAT1的转录调控机制目的:检测转录因子Sp1、Sp3对MALAT1启动子活性、转录结合的作用,初步探讨转录调控机制。方法:通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测Sp1/3与MALAT1上游1000bp启动子区域是否存在直接的转录结合。其次,通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测Sp1/3探针(针对#4)与核蛋白是否能够结合。同时设计针对Sp1标准位点冷探针及冷探针Sp1/3(针对位点#4),检测生物素探针与核蛋白结合的特异性。最后,针对MALAT1启动子区(-400/-1bp)构建报告基因质粒,单独或联合将Sp1、Sp3表达质粒与之共转染HEK293T细胞,采用双荧光素酶报告基因技术(Dual Luciferase Reporter Gene Assay)检测不同 Sp1/3:MALAT1启动子报告基因比例时,转录活性的改变。并设计预测位点#4突变试验,观察突变对活性的影响。结果:ChIP实验发现5段区域均含有潜在结合位点,其中启动子区-85/-4bp结合效果最明显。生物素标记探针Sp1/3能与核蛋白明显结合,两种冷探针竞争后,结合均明显抑制。Sp1与Sp3均在转染质量为MALAT1启动子报告基因25倍时,启动子活性增高最明显,分别为5.8与4.9倍(P<0.05);维持转录因子与报告基因25:1的转染比例,Sp1、Sp3表达质粒共转染293T细胞,其中Sp1/Sp3在75:1时促进活性作用最强(P<0.05)。相应突变组明显对转录活性无促进作用,与野生组相比差异具有统计学意义(P<0.05),与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Sp1能联合Sp3促进MALAT1基因的转录,对区域-85/-4bp(包含#4位点)转录作用最明显。这为以后深入探讨Sp1和Sp3调节MALAT1转录的具体结合位点奠定基础,为进一步揭示MALAT1在肝癌中过表达的机制提供线索。同时Sp1/3作用位点可成为MALAT1高表达肝癌的潜在靶标,为日后将转录抑制相关药物(如光神霉素)加入MALAT1高表达肝癌的联合治疗策略提供理论依据。